铁皮石斛药材总生物碱含量测定

铁皮石斛药材总生物碱含量测定

剥皮石斛和米诺基是中国传统的稀有中药。具有滋阴清热、益胃生津、润肺止咳等功效。常用于各种疾病，如发烧、伤津、口干、口渴、后虚热等。生物碱是石斛药材中主要活性成分之一,具有抗肿瘤、抑制心血管、胃肠道疾病及止痛退热等作用。研究种质、形态特征、采收年限与铁皮石斛总生物碱含量的关系,揭示铁皮石斛总生物碱含量的变异规律,对铁皮石斛质量控制、优质铁皮石斛培育均有重要的理论价值与现实意义。1材料和方法1.1数据分析试剂UV2550紫外-可见分光光度计(上海第三分析仪器厂);SWB5200型超声清洗机(上海必能信超声有限公司);FA1104分析天平(上海天平仪器厂)。pH4.5缓冲溶液:0.2mol·L-1邻苯二甲酸氢钾(pH4.0),用0.2mol·L-1氢氧化纳调至pH4.5;0.04%溴甲酚绿溶液:称取溴甲酚绿40.0mg,加100mLpH4.5缓冲溶液溶解,滤过即得;0.01mol·L-1氢氧化钠无水乙醇溶液,氯仿,无水乙醇(以上均为国产分析试剂)。石斛碱对照品自制,面积归一法检测含量达99%。1.2样品采集和处理2008年11月至2009月2月,采集浙江省铁皮石斛人工栽培基地11个种质一至三年生(铁皮石斛萌蘖生理年龄)样品33个,云南省铁皮石斛人工栽培基地6个种质一年生(铁皮石斛萌蘖生理年龄)样品6个、齿瓣石斛D.devoninum样品2个,其中铁皮石斛样品采集地产量占全国90%以上。购买杭州胡庆余堂、杭州青藏奇珍铁皮枫斗(药材基原为铁皮石斛)样品2个,杭州吴山广场、杭州胡庆余堂、杭州青藏奇珍等枫斗(药材基原为非铁皮石斛)样品9个。浙江省人工栽培基地铁皮石斛药材样品详见文献。1.3测定了石膏总面积的测定1.3.1带酸性染料比色法样品在60℃烘箱中烘干,粉碎,过60目筛。取各种样品粗粉0.1g,用适量的氨水润湿密塞30min,精密加入氯仿10mL称重,水浴加热回流2h,冷却后,氯仿补足失重,过滤,以酸性染料比色法测定含量,试验平行3次。部分样品氯仿稀释后再进行测定。1.3.2吸收度的测定精密称取石斛碱1.00mg置100mL量瓶中加氯仿至刻度。精密量取1.0,2.0,3.0,4.0,5.0mL分别置分液漏斗中,用氯仿准确稀释至10.0mL,加入pH4.5缓冲液5.0mL和0.04%溴甲酚绿溶液1.0mL,剧烈振摇3min,静置30min,氯仿层经氯仿浸泡处理并干燥后的药棉滤过,取续滤液5.0mL加0.01mol·L-1氢氧化钠无水乙醇液1.0mL摇匀,以氯仿10.0mL为空白,同法操作,于波长620nm处测得吸收度。吸光度与浓度的回归方程为C=9.5429A-0.038,r=0.9998。在0.01～0.05mg,浓度(C)与吸光度(A)具有良好的线性关系。1.3.3测定角度的确定精取某一样品溶液10mL,另以氯仿10.0mL为空白,按“线性试验”项上操作,分别在0,10,20,30,40min测定吸光度。结果显示该显色在20min内稳定。1.3.4精密度测试精取0.001g·L-1的石斛碱溶液10mL,另以氯仿10.0mL为空白,其余操作同上,测定5次。结果显示,RSD1.7%。1.3.5样品溶液的提取取同一样品5份,按照样品中总生物碱提取步骤提取样品溶液,精取样品溶液10mL,另以氯仿10.0mL为空白,其余操作同上,测定吸光度。结果显示,RSD4.7%。1.3.6石斛碱提取样品溶液取某一已知含量样品5份,精密加入石斛碱对照品溶液,按照样品中石斛碱提取步骤提取样品溶液,精取样品溶液10.0mL,另以氯仿10.0mL为空白,其余操作同上,测定吸光度。平均回收率101%,RSD4.9%。2结果与分析2.1铁皮石斛总原则信息浙江人工栽培不同种质铁皮石斛总生物碱含量见表1,云南省人工栽培铁皮石斛、齿瓣石斛和市售枫斗药材总生物碱含量见表2,3,供试铁皮石斛其生物碱质量分数为0.0190%～0.0430%,其中浙江人工栽培骨干基地生产的铁皮石斛一至三年生药材总生物碱质量分数为0.0190%～0.0425%,云南一年生铁皮石斛总生物碱质量分数为0.0275%～0.0430%,市场购买铁皮枫斗(药材基原为铁皮石斛,年龄未知)为0.0325%,0.0390%,齿瓣石斛总生物碱为0.0230%,0.0245%,其他枫斗(非铁皮石斛)样品总生物碱为0.02250%～0.0875%。目前,浙江铁皮石斛骨干基地一般都在二至三年生采收,云南铁皮石斛骨干基地一般都在一年生采收,根据上述结果可以基本确定总生物碱明显偏离0.0190%～0.0430%的样品为非铁皮石斛,但总生物碱含量在此范围的样品也可能不是铁皮石斛。因此,总生物碱含量是鉴别铁皮石斛药材真伪与优劣的一个重要指标,但尚不能根据总生物碱单一指标辨别铁皮石斛药材真伪与优劣,必须结合多糖含量与其他活性化学组分才能真正辨别铁皮石斛药材的真伪与优劣。2.2不同生长年限的铁皮石斛总氧化酶含量表1同时可见,产地环境差异不大的浙江人工栽培铁皮石斛,不同种质总生物碱含量均存在极显著的差异。11个种质一至三年药材平均总生物碱质量分数1号种质最低,为0.0225%,12号种质最高,达到0.0392%,两者相差0.0167%。其中1～6号种质药材样品采自同一产地,栽培环境、栽培基质与基地管理完全一致,不同种质间总生物碱含量同样存在极显著差异,一至三年生样品平均值变幅为0.0225%～0.0305%。因此,人工栽培铁皮石斛其总生物碱含量的差异主要来自遗传差异。供试的浙江省11个铁皮石斛种质,一年生、二年生、三年生样品总生物碱平均值分别为0.0253%,0.0270%,0.0326%,其中一年生变幅为0.0190%～0.0360%,RSD22%;二年生变幅为0.0200%～0.0390%,RSD20%;三年生变幅为0.0205%～0.0425%,RSD21%。上述结果表明,铁皮石斛生物碱含量随着生长年限的增加而增加,不同生长年限(萌蘖生理年龄)的铁皮石斛总生物碱含量存在极显著的差异。比较表1与表2,3浙江、云南2个产地,浙江一年生铁皮石斛平均总生物碱为0.0253%,云南产地一年生铁皮石斛平均总生物碱为0.0343%,云南产铁皮石斛总生物碱明显高于浙江产铁皮石斛。这种差异的产生有可能是种质之间的差异引起的,也有可能云南省气候温暖湿润,铁皮石斛的年生长期比较长,有利于总生物碱含量的积累,但真正的原因还有待于进一步系统的试验分析。2.3不同类型样品总原则生物活性指标铁皮石斛形态特征与总生物碱含量存在显著差异见表4。浙江产铁皮石斛按茎的形态划分,可分为3大类型。类型Ⅰ总生物碱含量明显高于类型Ⅱ、类型Ⅲ,类型Ⅰ一至三年生样品总生物碱平均值为0.0313%,其他2个类型分别达到0.0275%,0.0288%。按叶片形态划分,狭叶型种质铁皮石斛总生物碱含量明显高于宽叶型,狭叶型种质一至三年生总生物碱平均值为0.0329%,宽叶型种质一至三年生总生物碱平均值为0.0273%。3影响铁皮石斛总从机械元素含量的因素全国人工栽培骨干基地生产的一至三生铁皮石斛与市场购买的铁皮石斛,生物碱为0.0190%～0.0430%,因此总生物碱含量明显偏离此范围的样品可以基本确定为非铁皮石斛但总生物碱含量在此范围的样品也可能不是铁皮石斛,必须结合多糖含量与其他活性化学组分才能真正辨别铁皮石斛药材的真伪与优劣。