支气管哮喘豚鼠脑内cfos基因的分布

支气管哮喘豚鼠脑内cfos基因的分布

c-fos是指早期遗传因子，参与各种细胞的培养和生物合成调节过程。哮喘是由多种炎症细胞和炎症介质介导形成的慢性气道炎症,已经证实c-fos参与其炎症反应。然而,哮喘发作是否能导致豚鼠脑内相关核团c-fos发生变化,至今仍不清楚。本研究复制豚鼠哮喘模型,诱导c-fos原癌基因表达,用免疫组织化学法观察哮喘激活的脑区,以初步探讨神经中枢与哮喘发病的相关性。1材料和方法1.1动物和食物成年健康豚鼠14只,雌雄不分,体重350～450g,由第四军医大学实验动物中心提供。随机分为哮喘组(n=10)和对照组(n=4)。1.2哮喘组1.2.1氢氧化铝形式采用卵蛋白(ovalbumin,OVA)致敏和激发复制豚鼠哮喘模型。第1天腹腔内及皮下分别注射含20mg氢氧化铝的1%OVA生理盐水溶液1.5mL及0.5mL,一周后重复注射加强致敏,第四周动物以8L/min驱动流速Wright雾化器吸入1%OVA生理盐水溶液3～5min激发哮喘发作。哮喘豚鼠表现为呼吸急促,腹式呼吸,跌倒。诱发哮喘1h后开始以下步骤。1.2.2常规he染色豚鼠腹腔内注射戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉,开胸经左心室至升主动脉插管,先以100mL生理盐水冲洗血液,随后用冷的(4℃)含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸盐缓冲液(PB,pH7.4)灌流固定。灌毕取全脑及包括气管和主支气管的整个肺组织置于含30%蔗糖的0.1mol/LPB内(4℃)至组织块沉底。恒冷箱连续冠状切片,片厚30μm,贴片于1%明胶0.05%硫酸铬钾处理过的载玻片上。室温干燥30min后,取部分肺叶切片进行常规HE染色,其它切片用0.01mol/L的KPBS(pH7.4)浸洗,经80%甲醇+0.3%H2O2封闭,入含0.3%TritonX-100处理,然后按ABC法先进行抗Fos免疫组化反应。依次孵育于:兔抗Fos抗体稀释液(1∶3000,SantaCruz)24h(4℃),生物素标记的羊抗兔IgG(1∶500,Vector)2h(室温)和生物素-卵白素-HRP复合物(ABC,1∶500,Vector)2h(室温)。以上每一步骤之后均用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)充分漂洗3次,每次10min。然后用葡萄糖氧化酶-二氨基联苯胺-硫酸镍铵法呈色。最后常规裱片、脱水、透明、中性树胶封固、光镜观察。1.3对照组1.3.1生理盐水比较试验n.4用生理盐水代替1%OVA生理盐水溶液,其它步骤同哮喘组。1.3.2免疫组织化学染色的替代试验取实验组豚鼠部分大脑切片,用0.01mol/LPBS代替兔抗Fos第一抗体,再按ABC法进行免疫组化染色。1.4ca处理动物脑内fos阳性细胞的表达切片经图像分析仪(Quantimet570C,Leica)处理。每只豚鼠随机选取一套大脑切片,计算该套切片中各脑区内Fos阳性细胞的总和,而后在每组动物间取均数。哮喘组和对照组之间数据采用t检验进行统计分析比较。2结果2.1肺疾病的病理改变以及c-fos的出现2.1.1炎症细胞截面哮喘组气道壁和肺组织中可见大量炎症细胞浸润(主要为嗜酸性粒细胞和多形核白细胞),粘膜水肿,管壁内可见大量渗出的炎症细胞(图1)。对照组动物气道壁偶见少量炎症细胞浸润,粘膜结构完整。2.1.2fos阳性细胞Fos蛋白免疫反应阳性物质呈蓝黑色,主要分布于上皮细胞和多形核白细胞的胞核,胞质呈阴性反应,反差鲜明。哮喘组气道壁及肺组织中可见大量的Fos阳性细胞,主要为粘膜上皮细胞和浸润的炎症细胞,阳性炎症细胞主要分布于粘膜层、粘膜下层及平滑肌周围。对照组动物气道及肺组织中无或偶见免疫反应极弱的Fos阳性细胞。2.2c-fos在大脑中的表达2.2.1fos阳性细胞的分布、分布与延髓额叶皮质(Ⅰ、Ⅱ区)、扣带皮质(Ⅰ、Ⅱ区)、梨状皮质(图2A)和中央杏仁核(图2B)内有中等密度的Fos阳性分布。顶叶皮质、侧脑室周灰质、斜角带核及穹隆下器内散在分布。其它皮质及核团分布均稀少。下丘脑和丘脑区域Fos阳性产物主要密集分布于下丘脑室旁核(图2C)、丘脑室旁核和视上核(图2D),下丘脑外侧区和下丘脑室周核等有中等密度的分布,正中隆起内亦可见到少许Fos表达。小脑内无明显Fos分布密集区。中脑导水管周围灰质、臂旁核和脑桥核内有少量的Fos阳性分布。Fos阳性细胞在延髓的分布主要密集分布于中、尾段延髓的孤束核联合亚核、内侧亚核和最后区(图2E)内,其次分布于延髓腹外侧区(图2F)内。中间网状核、三叉神经脊束核和下橄榄核等也有少量的Fos分布。2.2.2免疫组织化学染色生理盐水对照组豚鼠脑内仅有散在的Fos分布,多为浅染且数量很少,无明显密集分布区。免疫组织化学染色替代实验的切片反应呈阴性。上述各部脑区及核团内Fos阳性细胞的图像分析结果见表1。3fos蛋白形态学显示方法在免疫调节中的应用目前大量研究已证实支气管哮喘是由嗜酸性粒细胞、肥大细胞和T细胞等多种炎症细胞参与的气道慢性炎症,但哮喘的发病机制至今尚未完全阐述清楚。体液免疫和细胞免疫都可参与哮喘的发病,而且速发型变态反应和迟发型变态反应也与哮喘的发病相关。神经免疫调节学是神经科学领域最新的分支之一,大量证据表明中枢神经系统(CNS)和免疫系统之间存在双向的联系。免疫应答过程可影响CNS的活动,CNS可接受免疫刺激信息并参与对免疫反应的调节。支气管哮喘的免疫应答是否有CNS的参与、以及其参与哮喘免疫应答的具体部位,现在仍不甚清楚。原癌基因c-fos及其表达产物Fos蛋白在神经元活动时表达活跃,被广泛用作神经元兴奋的标志物。Fos蛋白形态学显示方法的建立为研究免疫刺激信息的传导通路提供了一个快捷、敏感和方便的研究手段。虽然结果是通过形态学方法显示,但在某种程度上反映了一定的功能意义,因此是一种形态学和功能学相结合的指标。多种刺激均可引起Fos蛋白阳性表达,但在严格控制实验条件的前提下,Fos显示方法仍是一种非常方便和分辨率很高的方法。下丘脑是免疫应答的一个重要整合中枢,在神经免疫调节的研究中,常将下丘脑作为焦点。实验中我们观察到卵蛋白雾化吸入诱发的支气管哮喘不仅肺脏中c-fos表达较正常豚鼠明显增加,而且包括下丘脑在内的一些脑区,如额顶皮质、边缘前脑(扣带皮质、梨状皮质和中央杏仁核等)、丘脑室旁核、下丘脑室旁核、视上核、下丘脑外侧区、下丘脑室周核、孤束核、最后区和延髓腹外侧区可被激活。我们推测上述部位原癌基因c-fos表达可能与哮喘神经免疫调节密切相关。大鼠延髓中尾段存在一条从背内侧经中间网状结构至腹外侧的弧形带状区—延髓内脏带(MVZ),MVZ主要包括孤束核(NTS)、最后区(AP)和延髓腹外侧区,与内脏活动(心血管、呼吸和胃肠活动等)和神经免疫调节密切相关。卵蛋白刺激气道,可以记录到迷走神经感觉神经节—结状神经节放电增加。本文结果显示MVZ及其上行投射神经核团(下丘脑、杏仁核等)均有Fos表达,这提示MVZ可能与支气管哮喘的神经免疫调节调控相关。腹腔免疫信息可由迷走神经传递经MVZ中继再上传至下丘脑室旁核和中央杏仁核,哮喘所致的免疫刺激可否也可经迷走神经传递至MVZ再上传到下丘脑等高位中枢还待进一步研究证实。近年的研