大鼠脑内星形胶质细胞的表达、关系及分布

大鼠脑内星形胶质细胞的表达、关系及分布

根据文献，不同的刺激，包括生理和病理刺激，都能诱导大鼠大脑c-fos的出现。c-fos及其转移产物的出现表明脑血管激活，因此通常被用作神经功能研究的手段。传统观点认为,星形胶质细胞在神经系统中主要起着支持、营养的作用。然而随着认识的不断深入,胶质细胞的功能日益受到人们的重视。已证实:星形胶质细胞可接受神经元传来的信息,并以钙波的形式在胶质细胞内部传递,最终还可通过释放的谷氨酸反馈于神经元影响其功能,从而说明星形胶质细胞参与了神经信息的中枢整合。以往的应激模型多用于观察神经元的反应性变化,本研究则试图从神经元与胶质细胞相关的角度观察神经元和星形胶质细胞对生理性刺激(饮用3%NaCl,2d和5d)的反应,探讨神经胶质细胞—神经元通讯在维持脑功能中的作用。实验组和对照组的分组用SD成年雄性大鼠12只,体重180~230g,(本校实验动物中心)置于温暖(20℃)安静的环境饲养48h,随机分为实验组(n=8)和对照组(n=4)。1.试验组1.1经皮穿刺加热给予大鼠3%的氯化钠溶液替代正常淡水,分别饲养2d和5d后,用1%戊巴比妥钠(40mg/kg,i.p.)麻醉,迅速开胸经升主动脉插管,先以100ml生理盐水冲洗血液,随后用4℃的含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)先快后慢灌流固定。1.5h后取脑置于20%蔗糖中(4℃)直至组织沉底。用冰冻切片机切制大脑连续冠状切片,片厚30μm,每6张取1张,切片收集于0.01mol/L的PBS中。1.2抗fos药物反应切片经0.01mol/LPBS漂洗后,入含0.3%TritonX-100的PBS中浸泡30min(室温)后依次入:(1)兔抗FOS抗体稀释液(1∶3000,SantaCruz),室温孵育24h;(2)生物素标记的羊抗兔IgG(1∶500,Sigma)室温孵育2~4h;(3)生物素-卵白素-HRP复合物(ABC1∶500,Sigma)中室温孵育2~4h。然后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸镍铵法加强。以上每一步骤之后均用PBS液充分漂洗3次,每次10min(下同)。显色后,切片继续用ABC进行抗胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)反应。除用抗GFAP抗体稀释液(1∶3000,DAKO)替代抗FOS抗体稀释液外,其余步骤均与FOS反应相同。双标后的切片再进行抗酪氨酸羟化酶(TH)或加压素(VP)的第三次免疫组织化学反应,步骤如下:(1)切片在小鼠抗TH单克隆抗体稀释液(1∶5000,Calblochem)或兔抗VP多克隆抗体稀释液(1∶2000,Watpa)中室温孵育24h;(2)生物素标记的驴抗小鼠或羊抗兔IgG(1∶500,Sigma)中室温孵育2~4h;(3)ABC复合物中室温孵育2~4h。(4)DAB-H2O2溶液中进行棕色反应。结束三次染色的切片经漂洗后裱片、晾干、脱水、透明,封固后在光镜下观察并照相。抗FOS、抗GFAP单标和FOS/GFAP双标的程序为上述程序的一部分。2.对照组和对照组测试组2.1正常对照组大鼠给予正常淡水,在同样的环境下存活2d和5d之后在深麻下按实验组方法对动物灌流固定、切片和免疫组织化学染色。2.2比较实验大鼠给予0.9%的生理盐水,其它步骤同上,结果与正常对照组相同。2.3免疫组化反应取实验组脑切片,用0.01mol/LPBS分别替代抗FOS、抗GFAP以及抗TH抗体,按ABC法进行免疫组化反应,结果为阴性。结果1.gfp阳性细胞分布1.1gfap阳性细胞表达的部位除延髓内脏带(MVZ)的孤束核(NTS)、臂旁核(PB)、蓝斑(LC)(上述部位均与基本生命活动的调节有关)外,其它部位未发现有意义的GFAP阳性细胞表达。GFAP阳性细胞的胞体小,突起细,散在分布。1.2gfap阳性细胞在MVZ、PB和LC(Fig.3)GFAP阳性细胞较对照组明显增多,在MVZ主要分布于NTS的内侧部(Fig.1)和带中间部的内侧半,在MVZ的腹外侧区(VLM)GFAP阳性反应较少,胞体少,突起细短,染色浅;在最后区(AP)和血管周围、靠近软膜处,GFAP阳性细胞的突起较多并且大多指向AP。AP内GFAP阳性细胞紧密包裹血管。味觉核(GU)(Fig.2)、中脑导水管周围灰质腹外侧区(VIPAG)、上丘中灰层(InG)(Fig.4)也出现一定数量的GFAP阳性细胞。下丘脑室旁核外侧大细胞部(PaLM)(Fig.5)和腹侧部(PaV)(Fig.6)、下丘脑乳头体上核(SUM)、视上核(SON)(Fig.7)和穹隆下器(SFO)(Fig.8)等有较密集的GFAP出现。高倍视野下观察,胞体肥大,深染,纤维粗长。海马齿状回、杏仁核、大脑皮层Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ层也有一定程度的GFAP表达。皮层Ⅱ、Ⅳ层GFAP阳性细胞突起粗长,Ⅵ层胞体较小突起短,其它部位仅有散在分布。饮用高渗盐水5d者GFAP阳性细胞在数量上比2d者明显增多。2.fos阳性细胞分布2.1对照组除MVZ、PB、LC等有少量FOS阳性胞核外,其他脑区未见明显的FOS阳性表达。2.2中间带内半fos表达MVZ、PB、LC(Fig.3)等处的FOS阳性胞体明显增加,在MVZ主要集中分布于NTS内侧区(Fig.1)和中间带的内侧半,VLM较稀少,GU有密集的FOS表达(Fig.2),在中脑InG(Fig.4)、VIPAG;PaLM和PaV(Figs.5,6)、SON(Fig.7),弓状核(Arc)和SUM以及SFO(Fig.8)均有较多的FOS表达,以SON、PaLM和PaV最密集。3.fos-li+/th-li+/gfap-li+复合材料的结构在三重反应的脑片上观察到以下几种结构。(1)三标记复合体,有FOS-LI+/TH-LI+/GFAP-LI+和FOS-LI+/VP-LI+/GFAP-LI+。神经元胞核呈蓝黑色,胞浆为棕黄色,GFAP-LI细胞的胞体、突起为黑色并与神经元接触。FOS-LI+/TH-LI+/GFAP-LI+复合体主要分布于NTS(Fig.1);FOS-LI+/VP-LI+/GFAP-LI+复合体主要分布于SON(Fig.7)、PaV和SFO。(2)二标记复合体,有FOS-LI阴性(-)/TH-LI+/GFAP-LI+复合体和FOS-LI-/VP-LI+/GFAP-LI+复合体二种,其特点是TH或VP阳性神经元(胞浆棕蓝色)与GFAP阳性的星形胶质细胞接触,但神经元胞核FOS为阴性(Figs.1,6,7)。分布部位与三标记复合体相同。(3)二标记复合体FOS-LI+/GFAP-LI+复合体,在FOS阳性胞核周围有GFAP阳性产物包绕。在PB,VIPAG,InG,SUM等部位,主要是GFAP-LI+/FOS-LI+复合体。星形胶质细胞的活性可能GFAP是星形胶质细胞的骨架蛋白,构成中间丝,是星形胶质细胞的特异性标记物。用原位杂交方法可显示GFAP的mRNA,用免疫细胞化学技术可显示GFAP蛋白。研究发现正常大鼠脑内(主要是灰质)许多星形胶质细胞表现为GFAP免疫组化反应阴性。这一点从本文正常对照组的结果也可得到证实。研究证明,星形胶质细胞对刺激(伤害性或病理性)起反应,其标志之一是GFAP的表达上调,因此目前又将GFAP的表达作为星形胶质细胞活动状态的标志之一而被广泛使用。传统认为胶质细胞的功能是对神经元支持、营养和保护。近20多年来对胶质细胞结构与机能的研究也取得了较大的进展,特别是发现胶质细胞与神经元存在直接的往返的相互作用,并在中枢神经系统的信息处理中起着重要的作用。本文提出在大鼠脑内原位观察星形胶质细胞对渗透压改变的反应及与神经元之间关系的研究思路。采用抗GFAP(显示星形胶质细胞)与抗FOS蛋白和抗TH或VP等(显示神经元)相结合的免疫组化多重标记技术,以期在同一切片上显示神经元功能状态及神经活性物质的同时也显示星形胶质细胞活性状态。为从形态学上探讨神经元与星形胶质细胞对刺激的反应及其相互关系提供了有用的技术。本文的结果证实了以下二点:1.SON是渗透压调节的关键核团,已证明高渗状态下SON神经元被激活,FOS、JUN蛋白表达增强,并且存在时空效应,有些活性神经元的递质为儿茶酚胺类。作者的研究结果表明,不仅在与渗透压调节关系密切的PaLM、PaV和SONFOS-LI的分布与GFAP-LI星形胶质细胞的分布有明显的一致,在MVZ、室周器官及皮层等脑区及核团内两者之间亦有相伴关系。本研究还观察到NTS内GFAP-LI细胞的突起具有一定的趋向性,向AP方向延伸,排列整齐。值得一提的是在MVZ反应主要在NTS的内侧部,而VLM的反应弱,FOS稀少,与在血压变化实验中的结果不同(待发表),说明VLM与渗透压的调节关系较小。本文认为动物饮用盐水后,血液和脑脊液渗透压的变化首先激活了室周器官和近脑脊液处的星形胶质细胞,然后通过其与神经元之间的相互作用,将信息传给神经元。2.本文通过三重标记法,清晰地显示出在脑内对渗透压变化起反应的区域,被激活的神经元(FOS-LI)和星形胶质细胞(GFAP-LI)的形态及其相互关系。发现二者关系密切形成一个复合体样的结构,一个复合体包括一个神经元与若干星形胶质细胞,拟命名为神经元—星形胶质细胞复合体(Neuronal-AstrocyticComplex)。在反应区内未发现非复合体的形式的FOS-LI神经元或GFAP-LI细胞;在非反应区则未发现FOS-LI+/GFAP-LI+的复合体。作者通过双重免疫电镜技术证实星形胶质细胞的突起与神经元胞体,树突或轴突发生接触,有的部位二者胞膜的电子密度增加,膜增厚,可能是活性点。有意义的是渗透压变化时,在SON和NTS内这种活性点明显地增加(待发表)。因此作者认为这种复合体可能是中枢神经的功能单位。关于神经元与星形胶质细胞之间的密切关系,Grosche等在小脑Bergmannglialcell突起上发现了与神经元密切接触的“microdomains”,并认为它可能参与神经元与胶质细胞之间信息交流,从结构上支持了此复合体的存在。Alvarez-Mauebecin等证实蓝斑核内的星形胶质细胞与神经元存在同步膜