结核分支杆菌耐药基因检测方法的建立

结核分支杆菌耐药基因检测方法的建立

本研究在pcr-scp技术的基础上，建立了三种检测器官植物提取物残留基因的方法。分析了108例临床服药植物的突变，并探讨了银杏根杆菌突变与临床药物之间的关系。材料和方法1.培养基不同梯度药敏试验108例临床耐药株源于我院住院患者痰标本,经BACTEC-960培养和7H10培养基不同梯度药敏试验。链霉素(SM)、利福平(RFP)、异烟肼(INH)高浓度药物含量分别依次为4.0,40,400mg/L,低浓度含量分别依次为0.2,0.4,4mg/L,同时按“结核病诊断细菌学检验规程”进行菌种鉴定。2.试剂结核分支杆菌耐药基因检测试剂盒由本院结核病分子生物学实验室提供。7H10培养基由美国BD公司提供。3.sscp分析痰标本经前处理后,一部分进行药敏试验,另一部分进行BACTEC-960培养后,提取DNA,-20℃保存备用。PCR扩增:按试剂说明书进行操作,扩增分支杆菌耐SM基因(rpsL)产生267bp片段,耐RFP基因(rpoB)产生232bp片段,耐INH基因(KatG)产生273bp片段。SSCP分析:将临床分离株与结核分支杆菌标准株的DNAPCR扩增产物加在同一块8%(29∶1)非变性聚丙烯酰胺凝胶中,于4℃100~120V电泳6h,银染色后观察结果并照相。结果判定:双链PCR产物经变性后形成两条单链,经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳后呈现两条单链带。若所呈现的单链位置与野生型不同,称为泳动变位,即可判定存在基因突变。结果1.inh和sm敏感株108例临床标本中,耐株SM98株,其中高浓度耐SM株73株,低浓度耐SM株14株,11株为SM敏感株。耐INH78株,其中高浓度耐INH株64株,低浓度耐INH14株,30株为INH敏感株。108例中耐RFP78株,高浓度耐RFP66株,低浓度耐RFP12株,30株为敏感株。2.临床菌株sscp分析在108例结核分支杆菌耐SM、RFP、INH株中,rpsL基因扩增均产生267bp片段,rpoB均产生232bp片段,KatG均产生273bp片段。以TB标准DNA扩增产物为对照,98例耐SM分离株中,73例为高耐SM株,63株SSCP分析出现泳动变位的rpsL基因突变,14例低耐RFP株中,4株SSCP出现泳动变位,SM总突变率为68.5%(67/98)。78例耐RFP株中,64例为高耐RFP株,59株SSCP分析出现泳动变位,12例低耐RFP株中,2株SSCP出现泳动变位耐RFP总突变率为78.2%(61/78)。78例耐INH株中,64例为高耐INH株,54株SSCP出现泳动变位,低耐INH14例中有1株出现泳动变位,耐INH总突变率为70.5%(55/78)(表1)。3.108例临床多耐药株中,在高浓度有38株3种基因同时突变,15株为2种基因同时突变。在低浓度均为单纯基因突变,无2种基因或3种基因同时突变的现象。sm、rfp、inh基因突变引起耐SM(rpsL)、RFP(rpoB)、INH(KatG)基因突变的机理分别为:RFP抗结核作用机制是通过与结核分支杆菌RNA聚合酶的β亚单位的结合,干扰转录的开始和RNA延伸,编码β亚单位的基因被命名为rpoB。结核分支杆菌耐RFP的机制理论上有两种可能:一是药物作用靶分子RNA聚合酶β亚单位的突变;二是细胞壁渗透性改变导致药物摄入减少。在试验108例耐药临床标本中有7例高耐株和10例低耐株未突变,可能是属于第二种情况,或存在其他耐药机制。高耐药株突变占总突变数的86.5%,低耐药株占28.6%。SM主要作用于结核分支杆菌的核糖体,诱导遗传密码的错读,抑制mRNA转译的开始,干扰转译过程中的校对,从而抑制蛋白质合成。最近研究认为某些菌株耐SM是由于其核糖体S12蛋白编码基因rpsL或16SrRNA编码基因rrs突变所致,虽然rrs突变也会导致部分结核分支杆菌耐SM,但rpsL突变是SM耐药的主要分子机制。本研究显示,耐SM基因突变株绝大多数发生在高耐药菌株占89.3%,有4例在低耐区发生突变,可能因PCR-SSCP实验敏感,低耐区开始出现少量高耐药菌株的基因突变就被检测出来,这有待今后研究。异烟肼(INH)是酰肼类化学合成药物,结核分支杆菌对其高度敏感,但是也易产生耐药。最近研究表明,结核分支杆菌耐INH可能与过氧化氢酶——过氧化物酶编码基因KatG和烯酰基还原酶编码基因inhA或烷基过氧化氢酶编码基因ahpC改变有关,50%~70%的结核分支杆菌耐INH分离株KatG有突变,与本研究70.5%相同(表1),其中,高耐药株有54株,占总突变的84.3%,仅有1株在低耐药株突变。Zhang等首次从基因水平上对结核分支杆菌INH耐药性进行研究,发现在3株MIC>50μg/ml的高浓度耐药株中,有2株完全缺失KatG基因,认为结核分支杆菌KatG基因的完全缺失导致了过氧化氢酶不被表达,从而引起结核分支杆菌的INH耐药性。而8株高耐药株的KatG基因突变,更证实与INH耐药性有关。综上所述,SM、RFP、INH高、低耐浓度基因突变率,说明了耐药结核分支杆菌基因突变与传统药物敏感试验有密切联系,且耐药结核分支杆菌基因突变绝大多数发生在高浓度耐药株,少部分在低浓