我国新城疫病毒ndv的分子遗传研究

我国新城疫病毒ndv的分子遗传研究

新城病（nd）是一种由同一只鸟类引起的急性和烈性感染疾病，主要属于鸡和鸡。发病率和死亡率很高。这是中国养鸡业最严重的疾病之一。国际兽医卫生组织(OIE)将其定为A类动物疫病,中国将其定为一类动物传染病。NDV虽然只有一个血清型,但毒株众多,毒力差别较大,给ND的防制带来极大困难。NDV是一种具有囊膜的单股、负链、不分节段的RNA病毒,由15186个核苷酸组成。基因组包含6个基因,分别编码3′NP_P_M_F_HN_L5′六个主要多肽(即NP核蛋白、P磷蛋白、M基质蛋白、F融合蛋白、HN血凝素-神经氨酸酶和L聚合酶)。NDV的囊膜由F和HN两个糖蛋白组成,F糖蛋白能够融合宿主细胞膜,使病毒侵入宿主细胞内;HN糖蛋白具有血凝素和神经氨酸酶活性,在病毒侵染过程中识别细胞受体、介导病毒吸附细胞膜。这两种基因产物决定着NDV的毒力强弱。因此,对F和HN进行分子遗传变异研究,对了解和把握NDV的变异规律具有重要意义。然而,国内外尚未有F和HN基因遗传变异相关性的研究报告。本文对近年来在国内分离、鉴定的NDV,分别进行了F和HN基因克隆测序,并对二者的遗传变异做了相关比较。1材料和方法1.1材料表面1.1.1h9和h771999～2005年间山东、江苏等NDV分离株,采用HA和HI交叉抑制试验,排除H9和H5亚型禽流感、减蛋综合症(EDS_76)等具有HA特性的病毒。利用CEF对分离株进行蚀斑纯化3代后接种10日龄SPF鸡胚,进行病毒增殖,利用差速离心法进行浓缩病毒。1.1.2试剂和增强剂TRIzol为GibcoBRL产品;AMV逆转录酶、Rnasin、pGEM_TEasyVector购自Promega公司;DNA回收试剂盒、dNTPs购自TaKaRa(大连)公司。PCRMasterMix增强剂购自北京朋远公司。DH5α由山东农科院家禽所禽病重点实验室保存;SPF种蛋由山东家禽所SPF鸡场提供。1.1.3hn基因pcr扩增参照GenBank中NDV的F和HN序列,利用Primer设计两对引物,T1和T2用于扩增F基因(1700bp),HN1和HN2用于扩增HN基因(1801bp)。引物由上海Sangon合成,序列为:T1:5′_ATGGGCTCCAAACCTTCTAC_3′,T2:5′_TTGTAGTGGCTCTCATC_3′;HN1:5′_TCCGTTCTACCACATCACCA_3′,HN2:5′_CGTCTTCCCAACCATCCTAT_3′。考虑到NDV不同编码基因均有共同的起始序列,设计通用RT引物:5′_ACGGGTAGAA_3′。1.2加入rol/lrt的/amv体系按照TRIzol试剂盒说明提取病毒RNA,加入经DEPC处理的灭菌超纯水12μL溶解RNA。取7μLRNA,加入10mmol/LRT引物4.5μL,经70℃变性5min后,冰浴5min,依次加入下列体系:5×RTbuffer4μL;10mmol/LdNTP2μL;40U/μLRNasin0.5μL;10U/μL的AMV2μL,反应总体积20μL,混匀,37℃水浴1h。然后,95℃5min,冰浴5min,-20℃保存。合成的cDNA可作为PCR扩增F和HN的模板。1.3循环时间的选择F(HN)反应条件:94℃3min;94℃1min,54℃1min,72℃2.5min(HN为2min),33(HN为32)个循环;72℃延伸10min。反应产物1%琼脂糖凝胶电泳检验。1.4yvector的培养回收PCR产物,将回收物连接16℃1.5h至pGEM_TEasyVector,转化至感受态DH5α,均匀涂布于含Ampicillin、IPTG、X_Gal的LB固体培养基平板,37℃培养14～16h。挑取白色菌落小量培养,作EcoRⅠ酶切鉴定和PCR扩增双重鉴定。1.5ndv毒株的构建将阳性质粒送上海博采生物技术有限公司测序。另从GenBank中获取同时发表F和HN序列且代表不同基因型的11个NDV毒株(表1),用于这两个基因的比较。利用DNAStar6.0软件,按传统基因分型方法对F基因分型。1.6不同中毒猪f和hn基因遗传变化之间的相关比较1.6.1氨基酸aa同源性分析利用DNAStar6.0软件分别对NDV不同F和HN基因片段进行核苷酸(nt)和氨基酸(aa)同源性比较,利用SPSS8.0统计学软件对其同源性进行相关分析。以不同NDV毒株F全长基因的nt同源性为纵坐标,以不同毒株F基因高变区(1～374nt)的nt同源性为横坐标作图。按同样方法构建HN基因及其高变区(1～270nt)相关图。1.6.2基因同源分析利用DNAStar6.0软件分别对NDV的HN与F基因之间进行核甘酸同源比较,利用统计学软件SPSS8.0进行相关分析。以不同毒株间F基因的全长核甘酸同源性为横坐标,以HN基因的全长核甘酸同源性为纵坐标作图。2结果2.1内毒株的基因型和基因分型14个NDV野毒株的F和HN基因均扩增出了目的片段。经双向测序后,F基因开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)全长1662bp,编码553个氨基酸;HN基因ORF全长1716bp,编码571个氨基酸。序列已被GenBank收录(表1)。14株NDV野毒株基因分型结果:8株为基因Ⅶ(57.1%);4株为基因Ⅱ(28.6%);2株为基因Ⅸ(14.3%)。基因Ⅶ仍是目前NDV流行的优势毒株。2.2同源性分析结果表2为国、内外不同基因型的25个NDV毒株F基因全长和不同片段的核甘酸(nt)和氨基酸(aa)的相关比较结果。结果表明,不同毒株的1～374nt(125aa)、375～960nt(126～320aa)、961～1662nt(321～554aa)和全长的nt(aa)之间,核甘酸:r≥0.973;氨基酸:0.911≤r≤0.952,遗传变异高度相关。上述表明:不同NDV毒株在F基因上全长和片段的遗传变异都是密切相关的。其中,前374nt(125aa)最具代表性。F基因全长及其前374bp的核甘酸同源性比较见表3。图1更具体显示了NDV不同毒株间F全长基因与其前374bp遗传变异的一一对应的相关性。对近300个点的分析表明:当两个毒株间F基因全长nt同源性高时,其前374bp片段的同源性亦高,反之,亦然。推导公式为:Y=18.5+0.816X(Y表示F基因全长之间的nt同源性,X表示F前374bp之间的nt同源性)。2.3hn基因的基因型分布25个NDV毒株HN基因全长和不同片段的核甘酸和氨基酸的相关比较结果见表4。结果表明,1～270nt(90aa)、300～960nt(100～320aa)、961～1716nt(321～572aa)和基因全长的核甘酸和氨基酸之间,核甘酸:r≥0.983;氨基酸:0.924≤r≤0.968遗传变异高度相关。上述表明:不同毒株在HN基因全长和片段的遗传变异都是密切相关的。其中,前270nt(90aa)最具代表性。HN基因及其前270bp的核甘酸同源性的比较见表5。图2更具体显示了不同NDV毒株间,HN基因全长与其前270bp片段遗传变异的一一对应的相关性。对近300个点的分析表明:当两个NDV毒株间HN基因全长nt同源性高时,其前270bp片段的同源性亦高;反之,亦然。推导公式为:Y=36.2144+0.6357X(Y表示HN全长之间的nt同源性,X表示HN前270nt之间的nt同源性)。2.4dnav毒株间f和hn基因同源性分析25株NDVF与HN基因全长的核甘酸同源性具有显著的相关性(р<0.01),r=0.312**。图3具体显示了NDV不同毒株间F和HN基因遗传变异的一一对应的相关性。对近300个点的分析表明:当两个毒株间F基因全长同源性高时,其HN基因同源性大多数较高,但个别偏低。这表明:F与HN基因全长的遗传变异,呈现弱相关,既具有联系性,又具有相对的独立性。3讨论3.1f、hn基因不同片段的遗传变异国外学者对NDV研究发现:利用F、HN等基因中的不同片段所绘制的系统发育树十分相似,甚至利用较短的核甘酸序列所绘制的进化树与其全长基因所构建的进化树是一致的;国内秦智锋、曹殿军等也有类似的推论,但均缺乏有力的证据。本实验通过对代表不同基因型的25株NDV毒株的F和HN基因不同片段的核甘酸和氨基酸同源率进行比较,并通过统计学分析证实:不管是F还是HN基因,其不同片段的核甘酸和氨基酸与其全长之间息息相关,反应出NDV遗传变异的规律。F和HN基因内部不同片段之间遗传变异高度相关,反应出F或HN基因在自然界中的突变可能是随机的、均匀分布的。可以利用其中一个片段来推测F或HN基因全长的遗传变化。但应注意到:不同株NDVF或HN基因的不同片段,其核苷酸和氨基酸之间尚有一定差别,不同片段绘出的系统进化树有差异。因此,在进行遗传变异比较时,最好选择核甘酸和氨基酸(特别是后者)与全长均密切相关的片段,例如:F基因的1～374nt或HN基因的1～270nt。因为氨基酸与抗原性的关系更密切,更准确。3.2f与hn基因同源率低,其遗传变异国内外对NDVF或HN遗传变异的研究大都局限在对其自身的研究,其中对F基因的研究占了多数,对HN研究较少。本文把F和HN基因的遗传变异统筹考虑,通过对不同毒株NDV的F和HN基因全长之间进行核甘酸同源相关比较,证实F和HN基因之间的遗传变异既具有联系性,又具有独立性。联系性:国内10个NDV野毒株基因Ⅶ(本实验8株和2个国内株)之间,F基因核甘酸同源率为93.6%～99.1%,HN基因核甘酸同源率94.8%～100%,与疫苗株如LaSota(基因Ⅱ)的F和HN基因同源率均较低(80%左右)。表明目前流行的NDV基因Ⅶ野毒株与传统毒株相比,其F与HN基因均发生了较大的遗传变异,但野毒株之间具有较高的一致性。独立性:4个NDV基因Ⅱ野毒株与传统疫苗株LaSota(基因Ⅱ)相比,F基因同源率较高(98.9%～99.5%),HN基因同源率较低(79.2%～82.3%)。进而证实:基因型相同(F核甘酸同源率高),HN核甘酸同源率可能高(野毒株基因Ⅶ),也可能低(基因Ⅱ野毒株),具有不确定性;反之,亦然。例:国内NDV所有分离株HN之间高度同源(同源率94.8%～100%),但F基因同源率:同一基因型之间较高,不同基因型,则较低。因此,F基因分型的结果与HN同源率高低无关,反应出F与HN基因在遗传变异过程中各自的独立性。研究还发现:国内外不同国家和地区的情况也有差异:同一个地区,基因型相同,同源较高,否则,同源相对较低。如我国与欧洲NDV野毒株基因Ⅶ之间,F基因同源率不到90%,显示出地域差异。此外,国内NDV野毒株之间,不论是家禽,还是水禽,HN基因高度同源。何种原因导致此种现象值得进一步研究。3.3hn基因高度同源近年来,高抗