几种检测纤维素的方法比较

几种检测纤维素的方法比较

关于木霉等低质量细菌纤维素酶的研究报道很多。已经报告的纤维素酶的测定方法也很多，包括棉线法、滤纸坍塌法、cmc-t阈值降低法、染色纤维法、平板法和羧甲基纤维钠酶活性法。对具有较强对维生素分解能力的微生物（如细菌）的酶活性、酶活性和活性机制的研究较少，因此这些规则不适用于其他低质量的微生物。但目前对于这些方法测定的具体数值的可信度、可比性，却没有相关的报道研究。本次实验对报道较多的4种方法进行实验，研究这些实验方法的稳定性，从而为实验研究提供一定的参考依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1光光度计和工物用量HH-6型恒温水浴锅;22PC型分光光度计;HG1001型电热鼓风干燥箱;FA2004型电子分析天平;UV-2401型紫外双光束分光光度计1.2实验方法1.2.1试剂的制备1.2.1.l冰醋酸钠溶液6醋酸-醋酸钠缓冲液：11.8mL冰醋酸定容至100mL，称取27.2g的醋酸钠溶解并定容至100mL，将上述两种溶液等体积混合。1.2.1.结晶酚溶液的配制称取3,5-二硝基水杨酸6.3g于500mL大烧杯中，用少量蒸馏水溶解后加入2mol/LNaOH溶液262mL，再加入到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g无水亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后移入1000mL容量瓶中，用蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中，室温放置一周后使用。1.2.1.3-3c-na溶液称取0.625g羧甲基纤维素钠，加热溶解，定容至100mL。1.2.2酶活性测定1.2.2.葡糖糖的制备原理：3,5-二硝基水杨酸与还原糖共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定范围内还原糖的量和反应液的强度成比例关系，利用分光光度计测出其在520nm处的吸光度，得出还原糖的量。葡萄糖标准溶液的配制：将葡萄糖放在110℃烘箱中烘2h至恒重，称取0.1080g烘好的葡糖糖，溶解并定容至100mL。取16支具塞试管，依次编号为0,1,2,3,4,5,6,7并作平行实验。由于各种方法反应体系的总体积不同，所以需作不同的标准曲线，所加的量也有所不同。现以总体积为9mL体系为例：摇匀后置于沸水浴中加热5min后，冷却定容至25mL。摇匀后以0号管为对照于最大吸收波长处测定OD值，以葡萄糖含量μmol为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线。1.2.2.维素酶液的配制配制不同浓度的标准酶液：用去离子水100mL来溶解100mg纤维素酶（≥1000IU），配制成1mg/mL酶液。测定时分别吸取0.1mL,0.2mL,0.3mL,0.4mL,0.5mL,0.6mL上述酶液用水补足至1mL，即为不同浓度的酶液。1.2.2.葡萄糖mol数的检测滤纸是聚合度和结晶度都居“中等”的纤维性材料，以其为底物经纤维素酶水解后生成还原糖的量来表征纤维素酶系总的糖化能力的方法，此方法应用广泛，它反映了三类酶组分的协同作用，统称滤纸酶活(FilterPaperActivity,FPA)。方法：取1mL酶液加1mL0.1mol·L-1、pH4.6的醋酸缓冲液，预热到50℃，加入1条1×6cm新华滤纸(50±1mg)，50℃保温1h。取出，沸水浴灭活5min，冷却至室温，用3mLDNS试剂显色后稀释3倍，测OD值(520nm)。OD值越大，说明该菌株的酶活力越强。酶活力计算：从标准曲线中查出葡萄糖μmol数；其中：60为保温时间(酶与底物作用时间，min)；Ew为粗酶液的体积(mL)；u是指在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成1μmol葡萄糖的酶量。1.2.2.粗酶活力测定原理：纤维素酶对CMC-Na有降解能力，生成葡萄糖等还原糖，再用DNS法显色，用标准葡萄糖溶液作标准液，22PC分光光度计在520nm处测其吸光度，以每分钟生成相当于1μmol的葡萄糖为一个酶活性单位。取3支带有20mL刻度的试管，1支管作空白对照，2支管作平行样品管。每支样品管中加1mL酶溶液，置于50℃水浴锅中预热2min，然后在3支试管中分别加入4mL已预热至50℃的底物溶液，准确计时5min取出，每管立即分别加入1mL2mol/L氢氧化钠溶液和2mLDNS显色液，摇匀后在对照管中再加入1mL酶液。将3支试管放入沸水浴中，5min后立即取出，流水冷却，用蒸馏水定容至20mL，于520nm处测OD值。酶活力计算：从标准曲线中查出葡萄糖μmol数；其中：5为保温时间(酶与底物作用时间，min)；Ew为粗酶液的体积(mL)；u是指在特定条件下，每分钟催化纤维素水解成1μmol葡萄糖的酶量。1.2.2.吸光度的测定用考马斯亮蓝使滤纸染色酶解后在最大吸收波长处测释放的着色物的吸光值，代表酶活，以吸光度为纵坐标，酶浓度为横坐标做曲线。在实际测定时，先利用紫外双光束分光光度计进行波长扫描，发现其在536nm处吸收峰最高，因此在实验时以此波长作为测定波长。1.2.2.底物粘度测定底物溶液9mL，加酶液1mL,40℃，测定底物粘度减至一半时所需时间，以奥氏粘度计测定。以10min能使底物粘度降低一半的酶活作为一个单位。2结果与分析2.1葡糖糖的测定实验中所用的标准葡萄糖曲线绘制结果如下：由于在以后的测定中，各方法的反应体系并不相同，所以每个体系须有各自的葡糖糖标准曲线作为今后的参照。CMC糖化力测定参照图1，有三条曲线，是因为在常用测定中酶与底物不同，而造成它们各自体系的溶液的总体积也不相同，因此此方法的葡萄糖标准曲线有三条。滤纸法参照图2。所得三条曲线的回归方程如下：所得曲线的回归方程：2.2实验结果的比较酶活测定方法结果比较如下：所得曲线的回归方程：所得曲线的回归方程：实验结果表明：用标准纤维素酶所做的CMC酶活测定和滤纸酶活测定，从回归曲线可以看出他们的线性较好，可以充分说明这2种方法比较稳定。而且CMC酶活测定法和滤纸酶活测定法在很多报道中均在采用，这样使实际实验的结果更具可比性。所得曲线的回归方程：所得曲线的回归方程：由上述结果可知：CMC粘度降低法的线性没有滤纸酶活测定法和CMC酶活测定法来得好，而且在实验过程中，两个平行实验之间有较大的误差。但从回归方程就能看出，该方法的稳定性较其他3种方法有很大的偏差。3测定方法的比较本次实