激光扫描共聚焦显微镜下对孤束核表达fos的儿茶酚胺能神经元的观察

激光扫描共聚焦显微镜下对孤束核表达fos的儿茶酚胺能神经元的观察

独裁核（nts）是心脏感觉的初级引入，包括各种神经活性物质。在NTS的中尾段分布有大量儿茶酚胺能神经元和终末。大部分胸腹腔脏器的初级传入经VII、IX和X脑神经投射于NTS,向上主要投射至臂旁核(PB)。形态学和生理学都表明,NTS和PB广泛参与包括伤害性信息的内脏感觉信息的传递和处理。c-fos原癌基因是早期基因家族中的一员,当细胞接受刺激后,核内的c-fos原癌基因被激活,它的表达产物FOS在胞浆内合成后进入胞核调节细胞内其它基因的转录活性,从而将刺激与远期效应耦联起来。c-fos表达方法引入神经科学领域可检测受到包括伤害性刺激激活的神经中枢内多级神经元传导通路,从而可以将神经元的形态定位与机能研究结合起来。本文应用四甲基罗达明(TMR)逆行追踪,将福尔马林溶液给予胃粘膜引起伤害性刺激并结合FOS及酪氨酸羟化酶(TH)的免疫荧光组织化学反应,在激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)下,对大鼠NTS内向PB投射的可能参与内脏伤害性信息传递的儿茶酚胺能神经元进行了研究。免疫组化反应SD大鼠,雌雄不拘,体重190～250g。戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内注射麻醉后,开颅,在立体定位仪上用微量注射器将0.1～0.3μl的10%TMR定向注入右侧臂旁外侧核(LPB),注射时间为15～20min,注毕留针15min。动物于安静、避强光和适宜温度(15～18℃)的环境中喂养6d。12只实验动物分为实验组(n=8)和对照组(n=4)。实验组于术前禁食12h,在乙醚吸入麻醉下,用细塑料管向胃内注入2%甲醛溶液2ml。动物于数十秒内清醒,置于与刺激前相同环境中存活2h后,在戊巴比妥钠深麻醉下开胸,经左心室插管,先以100ml的生理盐水迅速冲洗血液,然后用500ml含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)灌注固定,持续30～50min。灌毕立即取脑,置入上述固定液中后固定4～6h,再移入含30%蔗糖的PB中至沉底(4℃)。冰冻连续冠状切片,片厚20μm,隔2片取1片,切片分3套收集于0.025mol/LPBS(pH7.4)中。在荧光显微镜下选择注射区局限于LPB的切片进行免疫荧光组织化学双重反应。第一套切片反应步骤如下:(1)入兔IgG抗TH血清(1∶1000,INC)和绵羊IgG抗FOS血清(1∶1000,本教研室李金莲教授惠赠)的混合液中室温孵育18～24h;(2)Cy5标记的驴抗兔IgG(1∶200,Chemicon)和DTAF标记的驴抗羊IgG(1∶100,Chemicon)的混合液室温孵育3h。各孵育液均用含0.3%TritonX-100、1%正常驴血清和0.03%NaN3的PBS稀释。上述各步骤之间,均用PBS洗涤切片3×10min。裱片,干燥,甘油和PBS(1:1)混合液封片。LSCM下观察、拍照并粗略计数。第2套切片进行Nissl染色,以便对照观察和定位免疫荧光组化反应和TMR逆标细胞的结果。实验组的第3套切片用PBS替代一抗血清孵育,同上法进行FOS免疫组化反应。对照组动物又分2组。第一组(n=2)将在术前环境内喂养的大鼠进行FOS免疫组化反应,以观察动物在基础状态下c-fos表达的状况。第二组(n=2)将置于术前环境的大鼠禁食过夜,吸入乙醚麻醉,清醒状态下存活2h后按上述方法操作。用以观察对照麻醉和禁食两个因素对c-fos表达的影响。细胞法上表达风险实验组大鼠在乙醚麻醉下向胃内插管注入少量甲醛很快即清醒,片刻即出现躁动不安以及呼吸加快、加深和弓背等行为,持续约1h。大鼠处死后解剖发现,胃肠道明显肿胀充血,胃壁粘膜有脱落面和点状出血,但未见穿孔。TMR注射中心大部分局限于LPB的外外侧、外内侧、中央外侧和背外侧亚核。双侧NTS内均见TMR逆标神经元分布,注射侧多于对侧。在适当波长的激光束激发下,在LSCM下可见NTS内标记Cy5、DTAF和TMR的神经元分别发出蓝、绿和红色荧光。采集的标本在荧屏上可单独显示一种荧光,也可同时叠加显示三种荧光。在NTS中尾段的内侧、胶质、小细胞亚核和连合亚核等处可见到7种类型的阳性反应神经元,即3种单一阳性神经元TMR、TH、FOS,3种双重阳性神经元TMR/FOS、TMR/TH、FOS/TH和TMR/FOS/TH三重阳性神经元,其中FOS标记胞核,TMR和TH标记神经元的胞浆(Fig.1)。TMR和TH阳性神经元胞体呈梭形、椭圆形和三角形,胞体直径约10～30μm,突起较长,多呈水平方向分布。TH样阳性神经元数量最多,TMR逆标神经元次之,FOS阳性神经元最少。选取3只反应良好的材料且大体位于NTS相同平面上的各3张切片进行计数,其结果为TMR/TH、FOS/TH双重阳性和TMR/FOS/TH三标神经元数量占NTS内TH样阳性神经元总数的百分比分别为44.2%(68/154)、26.6%(41/154)和12.3%(19/154)。此外在NTS上述亚核内还可见TH样阳性纤维终末分布,部分TH终末与TMR逆标神经元有接触现象。由于与TH样阳性神经元胞体(如TMR/TH,FOS/TH以及TMR/FOS/TH神经元)同为蓝色荧光,其接触关系尚难判定。对照组大鼠的胃肠道无明显变化。安静饲养和乙醚吸入组在NTS内可见少量散在的FOS蛋白表达,后者稍多于前者。一抗替代组未见到阳性细胞。nts内部分儿茶酚胺能神经元对内脏伤害性信息的表达LSCM具有高分辨率和高敏感性,能够同时观察到多种荧光标记物。这项技术的成熟为进行神经元之间的通讯和连接研究提供了方便。但由于荧光标记物在强光激发下容易发生淬灭现象,较难进行精确的细胞计数。本研究在观察时只能快速粗略地对多种标记细胞进行计数,实际标记细胞数量应高于计数结果。形态学研究已经表明,胃肠道的感觉初级传入主要终止于NTS中尾段的内侧、背内侧、胶质亚核和连合亚核等处,向上大部分投射至LPB的外内侧、外外侧、中央外侧和背外侧等亚核。本实验中TMR注射中心大部分局限于LPB上述亚核内,其逆标细胞分布与上述结果大体一致。NTS和PB都参与包括伤害性的内脏感觉信息的传递和处理。在给予胃肠道伤害性刺激后,NTS和PB的上述亚核都被诱导而发生大量FOS的表达。结合荧光免疫组化方法,在本实验中也观察到约26.6%的TH样阳性神经元表达FOS蛋白,其中约12.3%表达FOS的TH样阳性神经元投射至PB。有研究结果证明,NTS内表达FOS的部分儿茶酚胺能神经元投射至中脑导水管周围灰质腹外侧区,其中约31.4%的儿茶酚胺能神经元呈FOS阳性,本实验结果与其大体一致。以上结果说明NTS内部分儿茶酚胺能神经元参与内脏伤害性信息的传递。5-HT能纤维和终末和迷走神经初级传入纤维终末在NTS内与向PB