fa10的碳末端双甘酸缺失突变体对宫颈癌hela细胞增殖和凋亡的影响

fa10的碳末端双甘酸缺失突变体对宫颈癌hela细胞增殖和凋亡的影响

宫颈是大多数妇科疾病之一。世界上每年有50万人新病例，约30万人死于这种疾病，其中86%的新病例约占世界的一半。据统计,近些年来我国宫颈癌的发病率和死亡率持续上升,且其发病呈年轻化趋势。FAT10(HLA-Fassociatedtranscript10)也叫双泛素,是泛素样的修饰因子家族成员之一,分子量约为18kD。FAT10结构中包含有两个串联的泛素样结构域,分别与泛素有约30%的相似性。Hipp等研究发现,FAT10与泛素类似,能与靶蛋白结合,并介导其降解,在此过程中,其碳末端双甘酸结构发挥了重要作用。此外有研究发现,FAT10在肝癌、结直肠癌及宫颈癌等恶性肿瘤中表达上调,且干扰FAT10后可明显抑制肝癌细胞的增殖及诱导细胞凋亡,这提示其在肿瘤的发生发展中扮演着重要角色。本研究通过定点突变技术构建FAT10碳末端双甘酸缺失突变体,观察其对宫颈癌HeLa细胞增殖和凋亡的影响,初步探讨其在肿瘤发生发展中的可能机制。1材料和方法1.1来自本地格式的资源收集南方医院2013年手术切除的宫颈原位癌组织标本及正常宫颈组织各5例,患者年龄25~65岁,平均36.4岁。1.2抗鼠flagmort-pcr检测宫颈癌细胞株HeLa、真核表达载体pcDNA3.0-flag-FAT10和大肠埃希菌株DH5α由本室保存;DMEM培养基、OptiMEM及胎牛血清(Gibco,美国);DNAladder、MutanBEST定点突变试剂盒(TaKaRa,日本);质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒(康为,中国北京);鼠抗人FAT10单克隆抗体(Abcam,英国);顺铂注射剂、Anti-flagM2抗体(Sigma-Aldrich,美国);Anti-β-actin、HPP标记的抗鼠IgG(CellSignalingTechnology,美国);LipofectamineTM2000转染试剂(Invitrogen,美国);CCK-8试剂盒(碧云天,中国上海);AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡双染试剂盒(BD,美国)。其他试剂均为国产分析纯。引物合成及测序由Invitrogen公司(美国)完成。1.3免疫组化检测ndf-对所搜集的临床组织标本提取总蛋白,Westernblotting法检测FAT10表达水平。一抗为Anti-FAT10(1:1000稀释)、Anti-β-actin(1:1000稀释),一抗4℃孵育过夜后,与1:5000稀释的HPP标记的抗鼠IgG室温孵育1h,经SuperSignalWestPico化学发光底物(Thermo公司)显色,利用KodakIS4000R图像工作站进行化学发光检测。1.4引物序列及邻接以FAT10全长质粒为模板,利用MutanBEST定点突变试剂盒,将FAT10碳末端GG突变为VA。突变所用引物序列为:上游5'-TGATCTAGAGGGCCCTATTCTATAGTGTCA-3',下游5'-CGCTACAATACAATAAGATGCCAGGAAGAG-3'。此上游引物与下游引物5'端邻接,3'端方向相反。质粒构建好后,取少量重组质粒进行序列分析。1.5细胞培养和脂质体转移HeLa细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中,在5%CO2、37℃孵箱培养,待细胞生长至80%融合时进行传代。1.6westernblotting细胞转染检测取对数生长期的细胞,以3×105个/皿接种于3.5cm培养皿,分为4组,分别将野生型FAT10、FAT10碳末端突变体及空载体(阴性对照)瞬时转染至HeLa细胞,以野生型HeLa细胞作为空白对照组。待细胞融合至80%左右时,按照LipofectamineTM2000说明书操作,分别瞬时转染空载体、野生型FAT10及FAT10碳末端突变体。转染48h后,收集各组细胞进行Westernblotting检测细胞转染效率。一抗为Anti-flag(1:1000稀释)、Anti-FAT10(1:1000稀释)、Anti-β-actin(1:1000),其余步骤同1.3。4℃孵育过夜后,与1:5000稀释的HPP标记的抗鼠IgG室温孵育1h,通过Thermo公司的SuperSignalWestPico化学发光底物进行显色,利用KodakIS4000R图像工作站进行化学发光检测。1.7cck-8转染后光密度测定HeLa细胞以3×103个/孔接种于96孔板,分组同上,每组设5个复孔,分别于转染后第1、2、3、4、5天加入20μlCCK-8,继续孵育2h后,于酶标仪上检测各孔在450nm处的光密度(A)值。以培养时间为横坐标,A值为纵坐标,绘制细胞生长曲线。1.8质粒的转染HeLa细胞以3×105个/皿接种于3.5cm培养皿,分组同上,待细胞融合度达80%左右时,分别瞬时转染相应质粒。转染24h后,各组按终浓度为5μg/ml加入顺铂诱导凋亡,处理24h后,进行AnnexinV/PI染色,流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况。1.9实验数据的统计与分析采用SPSS13.0软件进行统计分析,实验数据以ue0af±s表示,各组间比较采用方差分析,多个均数间两两比较采用SNK-q检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1fat10蛋白表达Westernblotting检测发现正常宫颈组织和宫颈癌组织均可检测到FAT10蛋白表达,且宫颈癌组织中的蛋白表达量明显高于正常宫颈组织(图1)。2.2pcdna3。0-flag-fat10gg质量转移2.3fat十年及fat十年面临的表达blotting检测野生型FAT10及FAT10∆GG的表达HeLa细胞转染48h后,收集细胞,分别用flag抗体、FAT10抗体检测细胞内野生型FAT10及FAT10∆GG的表达情况。结果表明,野生型FAT10及FAT10∆GG重组质粒均可在HeLa细胞中有效地表达,含flag标签的重组蛋白分子量约18kD(图3)。2.4hela细胞增殖CCK-8法检测显示,与对照组和空载体组相比,过表达野生型FAT10可明显促进HeLa细胞的增殖(P<0.05),在转染后第5天,其促进效果更为明显(P<0.01);而过表达FAT10∆GG组细胞增殖率与对照组和空载体组比较差异无统计学意义(P>0.05,图4)。2.5fat十年2.2.2%4.2.24.2%4.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.28.23.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23334.234.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.24.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.23.流式细胞仪检测结果显示,各组细胞经顺铂处理24h后,过表达野生型FAT10组的细胞凋亡率(10.9%±2.0%)与对照组(22.7%±4.2%)和空载体组(24.1%±3.8%)相比明显下降(P<0.05),而FAT10∆GG组的细胞凋亡率(25.7%±5.1%)则仍处于较高水平(图5)。3fat10促进肿瘤的作用宫颈癌是一种严重危害女性健康的恶性肿瘤,传统的治疗采用手术为主、放疗为辅的方法。近几十年来,我国的宫颈癌发病率不断升高,且5年生存率较低,因此迫切需要探寻宫颈癌的特异性分子标志物,为其预防及早期诊断提供理论基础。FAT10是一种泛素样蛋白修饰因子,于1996年被发现。早期研究发现,FAT10在B细胞和树状细胞中均有表达,且在一些免疫器官如胸腺、淋巴结等表达水平较高,而在其他组织中其基础表达量均较低。到目前为止,FAT10的生物学功能仍知之甚少。近十年来,FAT10的研究主要集中在肿瘤方面。研究证实,FAT10参与了多种肿瘤的发生发展,过表达FAT10t可促进肝癌细胞的增殖,且减少喜树碱诱导的细胞凋亡。FAT10还可通过与MAD2(mitoticarrestdeficient2)结合,使染色质稳定性降低,从而促进肿瘤的发生发展。综上所述,FAT10在肿瘤发生机制中的作用已不可忽视。因此,探讨肿瘤发生发展过程中FAT10的作用具有重要的理论和临床意义。本研究结果显示,宫颈癌组织中FAT10的表达较正常组织明显升高,这与文献报道一致。过表达野生型FAT10可显著促进宫颈癌细胞的增殖,且对顺铂诱导的细胞凋亡有一定抑制作用。由于FAT10碳末端具有双甘酸结构,研究者认为此结构能够介导其与靶蛋白结合,从而促进靶蛋白被蛋白酶体所降解,当碳末端甘氨酸突变后,其共价结合蛋白质的能力消失。因此,我们推测FAT10可能主要通过其碳末端的特殊结构发挥作用。为了验证此假设,本研究首先构建了FAT10碳末端双甘酸突变体,将其转入HeLa细胞后,发现细胞增殖明显