大鼠孤束核内5-h能纤维和终末与nos阳性神经元的关系

大鼠孤束核内5-h能纤维和终末与nos阳性神经元的关系

氧气氮（no）是一个非经典信息传递的分子，近年来得到了高度重视。在体内,精氨酸在一氧化氮合酶(NOS)作用下,水解并氧化生成L-瓜氨酸和NO。NO对靶细胞的作用机制可能是通过活化鸟苷酸环化酶,升高cGMP水平从而触发一系列生物效应。NO还可能作为与经典递质相似的一种逆行递质,以弥散形式进入突触前神经元以调节突触前神经元的兴奋性。分布于周围和中枢神经系统的NO参与外周伤害性刺激信息的中枢传递和自主性调节。孤束核(NTS)是包括伤害性刺激在内的内脏感觉传入信息的中继核团,其传出纤维主要投射至臂旁核。在NTS内,NO作为内脏初级传入的神经递质以及作用于突触前结构的调制物,在心血管反射、胃肠道活动和含伤害性刺激的内脏信息的传递过程中发挥重要作用。NOS是NO能神经元的特异性标识物。形态学研究发现在NTS全长内均有较多的NOS神经元分布。NTS中、尾段分布有大量密集的五羟色胺(5-HT)能纤维和终末。它们主要来源于脑干下行性抑制系统的中脑导水管周围灰质腹外侧区、巨细胞网状核α部及以中缝大核为主的中缝核群。它可能作用于NTS内的NOS神经元,对包括伤害性信息在内的内脏传入信息传递发挥抑制性调控影响。目前对NTS内5-HT样阳性纤维和终末与NOS阳性投射神经元之间的相互联系问题的研究尚未见报道。激光扫描共聚焦显微镜具有高分辨率和高敏感性,可同时观察多种荧光标记物因而可为研究神经元之间的通讯和连接提供方便。本研究用四甲基罗达明(TMR)逆行追踪技术和免疫荧光组织化学双重染色技术,在激光共聚焦显微镜下,对NTS内向臂旁核投射的NOS样阳性神经元与5-HT样阳性纤维和终末之间的联系进行了观察。免疫荧光组织化学SD大鼠10只,雌雄不拘,体重190~250g。戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔内注射麻醉后,开颅,在立体定位仪上应用尖端外径为100μm的微量注射器,将0.1~0.3μl的10%TMR定向注入右侧臂旁外侧核(LPB),注射时间为15~20min,注毕留针15min。动物存活7d后,在戊巴比妥钠深度麻醉下开胸,经左心室插管至升主动脉,先以100ml的生理盐水迅速冲洗血液,然后用500ml含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸缓冲液(PB,pH7.4)灌注固定,持续30~50min。灌毕立即取脑,置入上述新鲜固定液后固定4~6h,再移入含30%蔗糖的PB中至沉底(4℃)。冰冻连续冠状切片,片厚20μm,隔2片取1片,切片分3组收集于0.025mol/L磷酸盐缓冲液(PBS,pH7.4)中。在荧光显微镜下选择注射区局限于LPB的切片,进行免疫荧光组织化学双重反应。第一组切片反应步骤为:(1)入兔IgG抗5-HT血清(1∶1000,INC)和小鼠IgG抗NOS血清(1∶1000,Sigma)的混合液中室温孵育18~24h;(2)Cy5(indodicarbocyanine)标记的驴抗兔IgG(1∶200,Chemicon)和DTAF(dichlorotriazinylaminofluorescein)标记的驴抗小鼠IgG(1∶100,Chemicon)的混合液室温孵育3h。各孵育液均用含0.3%TritonX-100、1%正常驴血清和0.03%NaN3的PBS稀释。上述各步骤之间,均用PBS洗涤切片3×10min。裱片,干燥,甘油和PBS(1∶1)混合液封片。激光扫描共聚焦显微镜(Bio-RadMRC-1024)下观察并拍照。第二组切片用PBS替代一抗血清孵育,其余步骤同上,进行对照实验,结果均为阴性。第三组切片进行Nissl染色,以便对照观察和定位免疫荧光组织化学反应和TMR逆行标记细胞。tmr表达逆标神经元/亚结构正常结构的发育在适当波长的激光束激发下,在镜下可见切片上被Cy5、DTAF和TMR标记的结构分别发出蓝、绿和红色荧光。应用计算机软件控制系统,在激光扫描共聚焦显微镜的显示器上既可显示采集标本的单色荧光,也可显示重叠存在的三种荧光。NTS中、尾段的背内侧、胶质、内侧、中间内侧、小细胞等亚核和连合亚核内有密集的5-HT样阳性纤维和终末(蓝色)(Fig.C),吻段以及其余各亚核分布较少。NOS样阳性神经元和纤维终末(绿色)分布于整个NTS,但在闩平面分布稀疏。其胞体呈梭形、椭圆形和三角形,横径约15~30μm。突起较长,多呈水平方向分布(Fig.B)。TMR注射中心大部分局限于LPB中段的外外侧、外内侧、中央外侧和背外侧亚核。NTS内向LPB投射的TMR逆标神经元主要分布于NTS中尾段,其胞体大小及形态与NOS阳性神经元大体一致(Fig.A)。在NTS中、尾段的内侧、中间内侧、小细胞和连合亚核内,可同时观察到TMR逆行标记和NOS阳性及二者双重阳性神经元与5-HT阳性终末重叠分布。取两只动物材料的各4张连续切片计数,TMR/NOS双重阳性神经元分别占TMR和NOS阳性神经元总数的8.3%(14/168)和18.4%(14/76)。在TMR和NOS单独阳性及其双重阳性神经元周围可见有较多的5-HT样阳性纤维和终末包绕(Fig.D)。这些5-HT样点状终末与NOS样阳性、TMR逆标及TMR/NOS双重阳性神经元的胞体和树突形成密切接触(Figs.D,E,F)。臂旁核神经元/nos神经元/nos表达形态学和生理学的研究证明,位于脑干的NTS和臂旁核参与包括伤害性信息在内的内脏感觉信息的传递和处理过程。NTS通过VII、IX和X脑神经接受头、颈、胸和腹腔大部分内脏的初级传入。其吻段1/3主要与味觉特殊内脏传入有关;中段的腹外和中间内侧亚核主要与呼吸器官有关;中、尾段2/3的背内侧、胶质、小细胞、内侧亚核和连合亚核主要与来自胃肠道和心血管器官的内脏感觉信息传入有关。将福尔马林导入大鼠胃内给予伤害性刺激,在NTS的内侧和中间亚核有大量的FOS阳性神经元分布。臂旁核以结合臂为界分为内侧臂旁核(MPB)和外侧臂旁核(LPB),又可进一步分为至少10个细胞形态结构以及纤维投射各异的亚核。NTS接受的内脏信息大部分先传至臂旁核经中介后到达上位脑结构。Horst等人应用WGA-HRP顺、逆行标记技术对NTS与臂旁核各个亚核之间的联系进行了详细的研究,发现与胃肠道相关的NTS中、尾段的内侧、背内侧、小细胞亚核和连合亚核特异地投射至臂旁核的外外侧、外内侧、中央外侧和背外侧亚核。电生理实验表明臂旁核通过脊髓背角浅层和NTS接受躯体和内脏伤害性信息。最近张文斌等用激光共聚焦显微镜研究也证明迷走神经初级传入终末经NTS内神经元中继后投射于LPB的相应部位。本实验的TMR注射区局限于LPB上述亚核,在NTS相应亚核内出现较多的TMR逆标神经元,与上述研究结果相一致。表明本实验观察到的位于NTS中、尾段的内侧、背内侧、小细胞亚核和连合亚核的TMR逆行标记神经元大部分可能接受胃肠道和心血管器官的内脏传入信息,向上投射至LPB的外外侧、外内侧、中央外侧和背外侧亚核。在NTS内有大量NOS阳性神经元和终末分布。以往的研究表明NO在NTS内参与心血管反射、胃肠道活动的调控。将NO的一种供体NOC18微量注入NTS引起血压升高、心率加快,而预先注入NO的一种耗竭剂CarboxyPTIO可使这一作用得到抑制。在人和大鼠三叉神经节和脊神经节中有大约10%的神经元呈NOS阳性,且均为主要发出传导伤害性信息的细纤维的中、小型神经元。同时在脊髓背角的Ⅰ、Ⅱ层和三叉神经脊束核尾侧亚核浅层存在大量浓密的NOS样阳性终末。NO作为跨膜信息传递物质还分布于NTS中尾段的内侧、背内侧、胶质和连合亚核内的内脏初级传入终末及神经元内。而NTS的上述亚核内投射至LPB的神经元主要与内脏伤害性信息传递有关,本实验中观察到这类投射神经元中的8.3%同时为NOS阳性。这些形态学资料提示:在NTS内含NO的投射神经元可能也参与内脏伤害性信息的传递和调控。5-HT作为下行性抑制系统的神经递质广泛作用于脊髓背角神经元参与对躯体伤害性感觉初级传入的调控。NTS的内侧、小细胞、胶质和连合亚核内有大量5-HT能纤维终末密集分布,这些5-HT能终末主要来源于脑干中缝核团和中脑导水管周围灰质的下行投射。5-HT在NTS内也发挥重要的调控作用。生理学研究发现将5-HT微量注入NTS引起剂量依赖性的低血压和心动减缓。NTS也参与伤害性信息的处理过程并与中脑导水管周围灰质和中缝大核有关。电镜研究还发现5-HT能终末与迷走神经初级传入终末与NTS内神经元的树突有突触连接现象。以上结果提示:5-HT能纤维终末通过直接作用于NTS神经元进行包括伤害性的内脏信息的调