硫酸皮肤素衍生物对大鼠肥大细胞脱颗粒的影响

硫酸皮肤素衍生物对大鼠肥大细胞脱颗粒的影响

硫酸脱硅酶（sd）是一种结构复杂、硫酸化的糖胺聚糖（gogga），广泛存在于动物组织中。它与硫酸乙酰肝素(HS)一样,是血管壁外层蛋白聚糖的主要GAGs成分。分子结构主要是由IdoA-α(1→3)-GalNAc和GlcA-β(1→3)-GalNAc以及它们在C2、C4和C6位上硫酸化的衍生物组成。DS除具有抗血栓、抗凝血等作用外,还具有多种生物活性,如免疫调节、保护血管壁、抗病毒、抗平滑肌细胞增生、抗炎等。多硫酸化DS(poly-sulfatedDS,PSDS)具有较强抑制补体活性的作用,这表明DS参与了炎症反应的调节。另外,DS是Versican(一种存在于细胞外间质的蛋白聚糖)的GAGs之一。Versican对黏附分子L-选择素(L-selectin)和P-选择素、趋化因子以及CD44的抑制作用依赖于其DS链与后者的结合,且DS链的硫酸化程度越高,其对L-选择素、P-选择素和趋化因子的抑制作用越强,而对CD44的抑制不依赖于DS的硫酸化。我们对不同分子量的LMWDS及PSDS通过大鼠被动肥大细胞(MC)脱颗粒实验,进一步探讨其结构与抗炎活性的关系。1实验动物及试剂硫酸皮肤素寡糖BLMWDS-1、BLMWDS-2、BLMWDS-3,牛肺来源,自制,批号:021023;PLMWDS-1、PLMWDS-2、PLMWDS-3,猪肠来源,自制,批号:021113;PSDS,自制,批号:021202;色甘酸钠,湖北潜江制药股份有限公司;卵清蛋白,自制;氢氧化铝凝胶,济南军区总医院药剂科;中性红,上海试剂三厂;Hank液(不含酚红,并用0.1mol/L磷酸盐缓冲液调pH值为6.9),自制。Wistar大鼠,山东大学实验动物中心,动物合格证号:20021226。LEICA显微镜,德国IEICA公司;超级恒温水浴,上海安亭科学仪器厂。2方法2.1不同剂量注射取卵清蛋白15mg,溶于4%氢氧化铝凝胶50ml,混匀,给5只大鼠分别腹腔注射1ml/次,隔日1次,共7次。两周后颈总动脉取血制备致敏血清,-20℃保存备用。2.2mc活性染料染色染色液:中性红0.05%无水乙醇溶液。活体染色片:取上述染色液2～3滴,滴于清洁玻片上,然后将玻片在酒精灯火焰上来回微温,待无水乙醇挥发后,染料即固定在玻片上,以供MC活体染色用。2.3沉淀物沉淀物制备将大鼠乙醚麻醉,由颈动脉放血致死。剪开腹部皮肤,将皮片向两侧翻开,然后向腹部内注入Hank液10ml,轻轻按摩腹部2～3min,打开腹部,以滴管将腹腔液收集于试管中,放入冰浴内冷却,1000r/min离心10～15min,弃上清,将沉淀物轻轻混悬在Hank液1ml中,放冰浴内备用,不能过夜。2.4药物用量的确定取试管9支分别加入正常大鼠MC悬液0.1ml,加入致敏大鼠血清0.05ml,摇匀,置37℃水浴中孵育2h,取出,加入Hank液0.2ml,摇匀,离心,弃上清,将细胞沉渣重新混悬在Hank液0.2ml中。9支试管中分别加入浓度为1mg/ml的表1中DS各衍生物水溶液、色甘酸钠溶液和Hank液各40μl,接触数分钟,然后加入卵清蛋白至20μg/ml,在37℃水浴中孵育5min,冷却,离心。用滴管分别吸取试管底部的MC,滴1滴于染色玻片上,轻轻晃动玻片,使液体与染料充分混合,放37℃温箱3min后,显微镜400倍下观察各试管中MC脱颗粒情况,计算脱颗粒率,并用数码相机照相。取试管15支,分成3组,分别加药物PSDS、BLMWDS-3、PLMWDS-3(药物浓度均为1mg/ml)。方法同上。每组药物用量为10、20、30、40、50μl。以上重复5次,分别计算MC脱颗粒率,并计算各组药物对MC脱颗粒的抑制率。MC脱颗粒抑制率(%)=(1-用药组MC脱颗粒率/Hank液组MC脱颗粒率)×100%3结果3.1物组和色甘酸钠对mc脱颗粒作用的影响对卵清蛋白抗原引起的MC脱颗粒,与Hank液组比较,各DS衍生物组和色甘酸钠组均能显著减少脱颗粒的MC数(P<0.01),与色甘酸钠组比较,PSDS组、BLMWDS-3组和PLMWDS-3组可显著抑制MC脱颗粒作用(P<0.01),结果见表1和图1。3.2抗癫痫药物对mc脱轨的影响的剂量效应关系PSDS、BLMWDS、PLMWDS抑制MC脱颗粒作用与剂量呈正相关(见图2)。4psds抑制mc脱颗粒作用机制MC脱颗粒是炎症发生的重要机制之一。DS衍生物对大鼠MC的脱颗粒具有抑制作用,不同来源的DS其作用不同,并且随着分子量的降低,其抑制作用加强。这是因为不同来源的DS具有不同的化学结构所致。PSDS抑制MC脱颗粒作用强,这与其结构上硫酸基的增加有关。有资料表明,肝素类药物能特异性阻断内