天然活性多糖的提取、分离和结构解析研究进展

天然活性多糖的提取、分离和结构解析研究进展

糖及其化合物是高等植物、动物膜和微生物细胞中自然界含量丰富的天然药物之一。与人类生活密切相关，在维持生活活动方面发挥着重要作用。这些物质与蛋白质、钠和酒精一起构成了最基本的四种生命物质。生物体内多糖除单独存在外,也有以结合方式存在的复合多糖,如与蛋白质结合在一起的蛋白多糖、糖蛋白,与脂质结合的脂多糖等。1988年,英国的Rademacher等几位多年从事糖类研究的科学家首次提出了“糖生物学”(Glycobiology),宣告了糖生物学这一分支学科的正式诞生。美国、日本、欧盟等政府机构争相增加相关研究和经费投入,致力于糖类研究。现代科学研究已经表明一切重要的生命活动,如细胞识别都有糖链的参与。在第一届国际糖工作年会上,会议主席宣称“生物化学中最后一个重大前沿,糖生物学的时代正在加速到来!”。美国《科学》杂志于2001年3月23日出版了一期专辑“糖和糖生物学”,表明对多糖的研究在国际学术界日益得到重视,其中对多糖结构和生物功能的研究成为继蛋白质和核酸之后探索生命奥秘的第3个里程碑。糖生物学、糖医药学和糖化学的研究已成为生命科学研究的热点。多糖来源广泛且无毒,近年来各国学者从各种生物体内提取了大量的生物活性多糖,这些多糖在免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗氧化和降血糖等方面显示出良好的应用前景,是比较理想的药物和保健食品基料。今后将有越来越多的具有不同活性的多糖被发现并应用于临床。1脱蛋白、脱色及分离纯化多糖既可存在于细胞壁外,又可存在于细胞壁内。若从动、植物中提取多糖,就要对细胞进行破碎,使多糖容易释放出来。因破碎后的细胞,其中的脂类物质也易连同多糖被提取出来,故需要预先脱脂。一般采用醇和醚类物质浸泡或回流提取来除去脂质,此时一些脂溶性色素也容易被除去。脱脂后的样品再用于多糖的提取。以水、盐溶液、稀酸或稀碱在不同条件下提取,提取液浓缩后经透析、沉淀、干燥得到粗多糖。当用碱性溶液提取时,需要在低温条件下提取,避免多糖发生降解。近年来,微波、超声和酶法辅助提取技术也开始应用于多糖的提取。提取得到的多糖溶液一般含有较多杂质,首先需考虑除去多糖提取液中的蛋白质。常用的脱蛋白方法有Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯乙酸法以及酶法等,其中Sevag是脱除蛋白质的经典方法,但其效率不高(需要提取3次以上),且多糖会有一定程度的损失。多糖中也常含有一些色素(游离色素或结合色素),根据其性质可采取不同的脱色方法。目前常用的脱色方法有离子交换法、氧化法、金属络合物法和吸附法(纤维素、硅藻土、活性炭)等。DEAE-纤维素法是通过离子交换作用来达到脱色的目的,并且能够分离纯化多糖。对于无机盐、色素、单糖和寡糖等小分子物质,可以采用透析的方法除去。提取、除杂后所得粗多糖通常是混合多糖,若要获得均一多糖,还需对多糖进行分离纯化。分离纯化多糖的方法很多[14,15,16,17,18,19,20],如分步沉淀法、季铵盐沉底法、柱层析法、超滤法和超离心法等,然而往往一种方法只能除去其中一种或几种杂质,不能一次性地获得均一组分。只有综合利用几种纯化方法才能达到纯化的效果。离子交换柱层析适合于分离各种酸性、中性粘多糖,是目前多糖纯化中应用最广的一种方法,特别是对于体积较大的多糖溶液,大多采取阴离子交换柱层析纯化的策略,使多糖得到初步纯化,甚至可以分离到均一组分。使用较为普遍的交换剂(填料)有二乙基氨基纤维(DEAE-cellulose)、DEAE-葡聚糖(DEAE-Sephadex)和DEAE-琼脂糖(DEAE-Sepharose)。这些交换剂具有三度空间网状结构,不仅具有离子交换作用,而且具有分子筛作用,柱效较高。凝胶柱层析常用的凝胶填料有葡聚糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)和聚丙烯酰胺凝胶(Bio-gel)等,以及后来开发出来的Sephcryl、Superdex等系列。使用凝胶填料进行多糖的分离纯化时,通常以不同浓度的盐溶液和缓冲液作为洗脱剂,使洗脱液具有一定的离子强度。多糖出柱的顺序是大分子先出柱,小分子后出柱,从而使不同分子质量的多糖得到分离纯化。然而凝胶柱层析不适合粘多糖的分离。2糖链的一级结构多糖结构比蛋白质和核酸的结构更为复杂,可以说是最复杂的生物大分子。从化学观点来看,多糖结构的复杂性无疑给其结构解析带来很大困难。糖的结构分类沿用了蛋白质和核酸的分类方法,即多糖的结构可分为一级、二级、三级和四级结构。与其它生物大分子一样,糖链的二级以上高级结构是以一级结构为基础的。不同的是,与蛋白质或核酸大分子相比,糖链的一级结构“含义”要丰富得多。测定糖链的一级结构,要解决以下几个问题:(1)相对分子质量;(2)糖链的糖基组成,各种单糖组成的摩尔比;(3)有无糖醛酸及具体的糖醛酸类型和比例;(4)各单糖残基的D-或L-构型,吡喃环或呋喃环形式;(5)各个单糖残基之间的连接顺序;(6)每个糖苷键所取的α-或β-异头异构形式;(7)每个糖残基上羟基被取代情况;(8)糖链和非糖部分连接情况;(9)主链和支链连接位点;(10)糖残基可能连接硫酸酯基、乙酰基、磷酸基、甲基的类型等。多糖结构的分析手段很多,不仅有仪器分析法,如红外、核磁共振、质谱等,还有化学方法,如部分酸水解、完全酸水解、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化反应等,以及生物学方法,如特异性糖苷酶酶切、免疫学方法等(见表1)。2.1相对分子质量测定多糖的相对分子质量是一项较为重要的工作,多糖的性质往往与其相对分子质量有关。多糖的相对分子质量只代表相似链长的平均分布,可以用量均相对分子质量(Mw)、数均相对分子质量(Mn)、重均相对分子质量(Mw)和粘均相对分子质量(Mv)表示。通常文献报道的相对分子质量是量均相对分子质量。目前测定多糖相对分子质量的方法主要有渗透压法、蒸汽压法、端基法、光散射法、黏度法、超过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、凝胶过滤法和HPGPC等。HPGPC测定多糖相对分子质量具有快速、高分辨率和重现性好等优点,在国内外得到广泛使用。2.2化学解释分析2.2.1gc-ms分析多糖水解后生成的单糖混合物或单糖甲基糖苷混合物可以用TLC、HPLC或GC等方法作定性鉴定和定量分析。GC分析时,待测样品要转换成易挥发、热稳定性好的衍生物,如糖三甲基硅醚、糖醇乙酸酯、糖三氟乙酸酯等。样品的水解方法有甲醇水解、盐酸水解、硫酸水解和三氟乙酸水解等,其中三氟乙酸水解法最为常用。2.2.3分子比例之过碘酸盐高碘酸及其盐可以选择性地断裂糖分子中的连二羟基或连三羟基,生成相应的多糖醛、甲醛或甲酸。糖的非还原末端或非末端的(1→6)-键与邻三元醇相似,其与过碘酸盐作用,糖环开裂得一分子比例的甲酸而消耗二分子比例之过碘酸盐。非末端的(1→2)-或(1→4)-键与邻二元醇相似,其开裂后产生二分子醛而消耗一分子比例之过碘酸盐。对于非末端之(1→3)-键或C-2和C-4有分枝的,则不受过碘酸盐影响。因此多糖氧化后定量测定过碘酸盐的消耗、甲酸的生成和剩余糖的比例,就可确定多糖中各种单糖的键型及其比例。多糖的过碘酸盐氧化一般在pH3~5的水溶液中进行(暗处)。过低pH导致酸水解,过高pH引起无选择性氧化。确定糖苷键的位置时,需要与Smith降解相结合。2.2.4氧化产物的降解Smith降解是将高碘酸氧化的产物还原后进行酸水解。由于糖基之间不同的位置缩合,因此用高碘酸氧化后生成不同的产物。将氧化产物用硼氢化钠还原成稳定的多羟基化合物,水解后用纸层析或者GLC鉴定水解产物,由降解的产物推断糖苷键的位置。由于实验中加入乙二醇终止反应,所以检测终产物中乙二醇没有意义,一般以甘油、赤藓醇和其它糖等作为糖苷键的特征终产物。2.2.5多糖甲基化的检测甲基化分析是确定寡糖和多糖中单糖间糖苷键位置的重要手段。其原理是:先将多糖中各种单糖残基中的游离羟基全部甲基化,将甲基化多糖水解得到甲基化的单糖进行衍生处理,最后用GC-MS方法结合标准谱图分析,可得到部分甲基化单糖衍生物的归属,从而确定单糖残基的连接位点。同时根据不同甲基化单糖的比例推出这种连接键型在多糖重复结构中的比例。然而甲基化分析无法确定异头碳糖苷键构型和单糖残基的顺序信息。多糖甲基化通过一系列的改进,目前有多种方法,如Purdie法、Haworth法、Menzies法、Hakomori法、Cicanu法、Needs法等,其中Needs改良的甲基化方法较为常用(见表2)。针对易溶于水、难溶于DMSO的多糖,可以先用少量水使多糖溶解,再与DMSO混合,然后加入分子筛脱水,采用Needs法进行多糖甲基化,可得到甲基化程度比较完全的产物。在甲基化分析过程中,需要注意以下几点:(1)多糖甲基化后用红外检测其是否含有羟基,如果仍有羟基峰存在,则表示甲基化不完全,需重复进行甲基化或者采用氯仿等溶剂将已甲基化的多糖萃取出来并作后续处理分析;(2)含有糖醛酸或氨基己糖残基的多糖比较难甲基化,可能会产生二级产物。对于含有糖醛酸、氨基己糖以及某些取代基团的多糖,在甲基化分析时需要考虑甲基化和酸水解是否会引发副反应。2.3质谱及质谱条件的应用紫外-可见光谱是多糖结构研究中常用的仪器分析方法之一,如采用苯酚-硫酸法、蒽酮-硫酸法等测定多糖含量,咔唑-硫酸法测定糖醛酸含量,柱层析过程中利用苯酚-硫酸法绘制多糖洗脱曲线,考马斯亮蓝法或Lowry酚试剂法测定多糖复合物中的蛋白含量等。在波长280、260nm处考察多糖中是否含有蛋白、核酸等。利用红外光谱中多糖的特征吸收峰,可鉴定多糖中糖的种类、糖环构型,提供异头碳的信息。在多糖结构分析中气相色谱法(GC)主要用于单糖组成、糖醛酸种类和组成、Smith降解产物等分析。GC具有样品用量少、分辨率强、灵敏度高、分析速度快等优点,然而该法需要对多糖样品进行处理,衍生成易挥发、对热稳定的衍生物后再进行分析。液相色谱法(HPLC)也可用于糖的分析,如多糖纯化及其相对分子质量测定,单糖组成、糖醛酸种类分析以及糖含量测定,通常选用示差检测器。在糖类的研究中,质谱显示出不可替代的作用。GC-MS已广泛应用于糖组成分析和甲基化分析,以确定糖残基连接方式。上世纪80年代各种软电离技术的诞生,如快原子轰击质谱(FAB-MS)、电喷雾质谱(ESI-MS)、基质辅助激光解析离子化质谱(MALDI-MS)等(见表3),使糖结构分析研究取得了日新月异的发展。自从核磁共振(NMR)技术引入糖化学中,对多糖的结构分析有了重要进展。一维的NMR包括1H-NMR和13C-NMR。1H-NMR主要解决多糖结构中糖苷键构型问题,由于不同残基中非异头质子的亚甲基和次甲基化学位移非常靠近,集中在3.0~4.0ppm狭小区域内,因此给解析带来困难。6位脱氧糖的甲基和异头质子信号是1H-NMR图谱解析的突破口,通常α型糖苷异头碳的质子信号大于δ5.0,β型糖苷异头碳的质子信号一般小于δ5.0。1H-NMR能提供多方面的信息,但其不足之处在于需要与相关的化合物结构进行比较,才能得出明确的结论。当研究一个全新多糖时,明确质子的归属很困难。13C-NMR的化学位移较1H-NMR广,可达2×10-4,谱线很少重叠,能确定糖残基的相对数量、糖链的连接位置,还可以确定某些单糖种类,因此用于多糖结构的研究很有潜力。一般来说,α型连接的C1化学位移在97~101ppm之间,β型在103~105ppm之间。随着计算机技术的发展,2DNMR技术也迅速发展起来,尤其在复杂多糖化合物的结构研究中扮演重要角色。2DNMR使多糖的1H-NMR和13C-NMR得到归属,能给出相关碳氢连接方式的信息,从而使确定多糖的全结构成为可能。2DNMR是经过2次傅里叶变换得到2个独立的频率变量的谱图。在多糖的结构研究中,常采用同核位移相关谱中的COSY(化学位移相关谱)、DQF-COSY(双量子滤波COSY)、TOCSY(三量子滤波COSY)等。由于缺乏质子间的交叉峰连接,所以单靠COSY谱不能完成多糖中各个糖环质子的识别,TOCSY(全相关谱)等可以作为COSY的补充和验证。此外,HSQC(异核单量子相关谱)和HMBC(异核多键相关谱)等碳氢相关谱也是需要的。HSQC反映的是直接相连的1H、13C核之间的耦合关系(1JCH),HMBC把1H核与长程耦合的13C核关联起来,提供分子骨架的结构信息(见表4)。在分析多糖结构时,2DNMR谱中需要COSY-45、HSQC和HMBC,其它谱图对识别氢核也有一定帮助。尽管一些结构复杂、相对分子质量大的多糖用2DNMR还不能完全解析,但随着NMR技术的不断发展,人们将从中获得更多的信息。3调节分子研究对多糖的功能研究主要集中在2个方面:一是作为非特异治疗剂,作用于相类似的对应分子,调节各种生理功能或纠正病理过程,这类研究目前较多;二是作为信息分子进入机体,发挥补充调节或抑制的作用。虽然目前这类研究较少,但随着糖功能基因的发现,其特异性治疗将不断涌现。3.1车前子多糖的药代动力学作用多糖的免疫调节功能是其最重要的功能活性,多糖能在多条途径、多个层面对免疫系统发挥作用。具体表现在:(1)提高巨噬细胞吞噬能力。植物多糖对巨噬细胞的免疫调节作用主要表现在影响巨噬细胞活性氧的产生、细胞因子的分泌(如白细胞介素IL、肿瘤坏死因子TNF、干扰素IFN集落刺激因子CSF等)、细胞增殖和吞噬活性等,从而起到对天然免疫和适应性免疫的调控作用。从Aloebarbadensis分离得到的甘露聚糖表现出显著的刺激单核巨噬细胞生成的效应,车前子多糖具有抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬活性、刺激体外RAW264.7巨噬细胞增殖并提高NO释放的作用。(2)对T、B淋巴细胞的作用。香菇多糖是一种典型的T淋巴细胞增强剂,在体内外均能促进特异性细胞毒T淋巴细胞的产生,提高该细胞的杀伤活性。(3)对NK、LAK细胞的作用。大量的研究表明猕猴桃茎多糖、牛膝多糖等对NK、LAK细胞活性都有增强作用,其增强作用呈剂量依赖性。(5)通过不同途径激活补体系统。有些是通过替代通路激活补体,有些是通过经典途径,这一类多糖有柴胡多糖和三七多糖等。(4)以促进树突状细胞(DCs)增殖、表面表达分子MHCⅡ分泌等方式促进DCs诱导的免疫应答启动,比如灵芝多糖可明显刺激小鼠脾脏DCs增殖。大粒车前子多糖通过促进DCs表面MHCⅡ类分子、共刺激分子的表达及Th1型细胞因子的分泌,刺激T淋巴细胞的增殖,诱导Th1型免疫应答并增强CTL对肿瘤细胞的特异性杀伤活力;通过促进DCs表面趋化因子受体CCR7mRNA的表达,促进DCs的移行和发育成熟,即通过对DCs移行、成熟、功能的上调作用而促进免疫应答的启动,增强机体的免疫功能。3.2诱导和调节免疫反应,细胞激活或致死肿瘤细胞根据多糖的抗肿瘤作用将其可以分为两大类:一类是具有通过激活机体的免疫系统,诱导细胞分化,刺激造血,抗转移,抗新生血管生成,诱导NO产生等生物活性的多糖,这类多糖与机体的免疫细胞通过分子水平的接触,免疫细胞被激活,释放出某些类型的细胞转导信号,从而激发和增强免疫反应,再通过增强机体的免疫功能间接抑制或杀死肿瘤细胞。具有抗肿瘤活性的多糖大多是通过这种途径发挥作用的。例如,人们从植物、细菌和真菌中提取到β-葡聚糖,通过研究表明β-葡聚糖与机体免疫细胞受体存在特异性结合,这种结合使免疫细胞(巨噬细胞、T和B淋巴细胞及其它效应细胞)迅速处于激活状态,而且可以活化信号传导的路径并调节某些细胞因子的释放,诱导和调节免疫反应,抑制肿瘤或癌细胞的生长繁殖[51,52,53,54,55,56]。另一类是具有细胞毒性的多糖,可以直接杀死肿瘤细胞,如牛漆多糖、青钱柳多糖和茶多糖均可以抑制癌细胞体外生长,青钱柳多糖可以显著抑制人宫颈癌Hela细胞的生长,诱使细胞发生凋亡,使细胞在S期发生阻滞。然而后一类多糖在体外直接杀伤肿瘤细胞的机制还不是很清楚。3.3硫酸多糖的免疫活性20世纪70年代以来,已经发现许多多糖具有抗疱疹病毒及流感病毒作用,如对艾滋病毒、巨细胞病毒、单纯疱疹病毒等有明显的抑制作用。多糖通过以下方式达到抗病毒的作用:抑制病毒抗原的表达,抑制病毒逆转录酶的活性以及抑制病毒表面蛋白gp120与细胞表面CD4受体结合等。如灵芝中的糖蛋白是通过与病毒分子结合,阻止病毒分子与细胞之间的结合感染。硫酸多糖无论在体外还是在体内,都显示出不同程度的抗病毒活性。硫酸多糖包括从植物中提取到的各种肝素、硫氨多糖、天然中性多糖的硫酸衍生物和人工合成的硫酸多糖,是一类多聚阴离子多糖,带有大量负电荷。目前认为其抗病毒机理可能是硫酸多糖掩蔽了病毒或细胞表面的正电荷区域,从而抑制了病毒的吸附。有研究发现,匀多糖的硫酸酯抗病毒活性大于杂多糖硫酸酯的活性;相对分子质量大小、硫酸化程度、硫酸基的分布等因素均会对硫酸多糖的抗病毒活性有一定影响。3.4活性化合物近年来,人们对多糖及其复合物的抗氧化活性研究越来越深入。许多从天然产物中分离得到的多糖类化合物具有清除自由基,抑制脂质过氧化、亚油酸氧化等抗氧化作用,其可能的抗氧化机理有:直接清除活性氧,络合产生活性氧所必需的金属离子,提高抗氧化酶的活性等。提示多糖的抗氧化性可能是抗肿瘤、抗衰老、抗感染等的作用机理之一。车前子多糖具有体外清除DPPH自由基、超氧阴离子自由基、羟基自由基等抗氧化能力。从茶叶水提物中分离、纯化得到的3个多糖组分,其中相对分子质量为4.2×104的TPC-3组分的抗氧化能力明显高于相对分子质量为26.8×104和11.8×104的组分。黑灵芝多糖能抑制缺氧/复氧引起的LDH的释放及细胞活力的下降并呈剂量依赖性(可达100μg/mL),这种保护作用也伴随着减少MDA的含量,增强SOD、CAT、GSH-Px活性及蛋白表达,并且能减少缺氧/复氧引起的ROS的释放及细胞凋亡。此外,黑灵芝多糖通过调节半胱氨酸蛋白酶、Bcl-2和氧化还原系统保护心肌细胞,防止缺氧/复氧诱导的线粒体介导的细胞凋亡。3.5对肝脏糖代谢的影响天然多糖的降血糖作用主要表现在降低肝糖原,促进外周组织器官对糖的利用,促进降糖激素和抑制升糖激素作用,保护胰岛细胞以及调节糖代谢酶活性等方面。冬虫夏草多糖能显著提高肝脏中葡糖激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性,降低血浆甘油三酯及胆固醇的水平。百合多糖可以修复β-胰岛细胞,增强分泌胰岛素功能和降低肾上皮质激素分泌,并可促进肝脏中血糖转化为糖原的联合作用,从而使血糖降低。黄芪多糖对血糖及肝糖元有双向调节作用,既可保护低血糖,又可抗实验性高血糖。其它具有降血糖作用的多糖有青钱柳多糖、人参多糖、灵芝多糖、茶多糖等。3.6在生命活动中的应用近几十年来,对多糖的相关研究包括膜的化学功能和免疫物质的研究以及寻找新药资源等,人们在研究中发现多糖在生物体内不仅作为能量物质或结构材料,更重要的是其可以携带巨大的信息量,而成为参与生命活动中形形色