2013年德宏州瑞丽市登革热暴发疫情调查

2013年德宏州瑞丽市登革热暴发疫情调查

登革热（df）是由、、和引起的急性感染。主要通过埃及红足虱（aedu3000抗癫痫）和白纹红足虱（aedu3000寄生虫）传播，在世界温带和亚热带地区广泛流行。近10年来,我国广东、福建、浙江和江苏等省曾发生过因输入性病例引起的本地流行。云南省位于我国西南边境地区,与DF地方性流行区的越南、老挝、缅甸和泰国相邻,边境线长4u3000060km,境内外人员和物资交流频繁,该病可通过多种方式传播到云南省并引起流行。自2000年以来,云南省几乎每年都有来自境外的DF输入性病例的报告,2008年云南省瑞丽市还发生了该省历史上最大的一起输入性DF暴发。2013年瑞丽市首次发生本地DF暴发,为掌握该起疫情的分子流行病学特点,本课题组对患者血清标本进行了DENV核酸检测及其基因序列分析。1u3000denv基因核苷酸基因型判定1.1病例资料DF病例资料来源于中国疾病预防控制中心疫情信息报告网络系统以及登革热病例个案调查表和流行病学调查资料。根据《登革热诊断标准》对病例进行诊断,所有DF病例均为实验室诊断病例。人口数据来源于瑞丽市统计局。1.2病例定义输入性病例:指本地无DF流行,发病前15d内来自或到过有DF流行的国家或地区、有蚊虫叮咬史的DF病例。本地感染病例:指发病前15d内未离开过瑞丽市或未到过DF流行的国家或地区的DF病例。1.3标本采集采集DF疑似和临床诊断病例的急性期(发病后0~5d)血清。无菌真空采血管采集患者静脉血液,经3u3000000r/min离心5min,血清置于2ml螺旋盖冻存管,立即进行DENV抗原检测,其余血清标本保存于-70℃冰箱。所有标本的DENV-NS1抗原检测均在瑞丽市疾病预防控制中心完成;分子生物学检测在云南省地方病防治所病毒实验室完成。1.4u3000DENV-NS1抗原检测NS1抗原检测试剂为美国CTK生物有限公司产品。按说明书操作,在检测卡上标记病例编号,取1滴血清或全血滴在加样孔中,加1滴缓冲液到加样孔中,25min内读取结果。当质控区和样本区均出现条带时则判为阳性;仅质控区出现条带,而样本区未出现条带则判为阴性;如质控区未出现条带则试验无效。如在急性期血清中检测到DENV-NS1抗原,表明该患者感染了DENV。1.5u3000DENVu3000RT-PCR试验用QIAampu3000ViralRNAu3000Miniu3000Kit(美国QIAGEN公司)提取患者血清中的病毒RNA,用Amershamu3000Bioscienceu3000Ready-To-GoTMu3000Youu3000Primeu3000First-Strandu3000Beads(美国Amershamu3000Pharmaciau3000Biotech公司)制备cDNA。取2μlu3000cDNA做反应模板,以D1和D2为引物(表1),PCR扩增目的基因,反应条件为94℃预变性2min,94℃30s、55℃30s、68℃30s,扩增9个循环后,94℃30s、55℃30s、68℃30s(每个循环增加10s),扩增25个循环,68℃延伸10min。反应结束后,取2μl产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果,如果条带分子量与预期片段大小相同,表明为相应的DENV核酸扩增阳性。1.6序列测定和分析本研究中所有PCR扩增产物的测序均在生工生物工程(上海)股份有限公司完成。采用ClastalX1.83进行核苷酸序列比对,采用MEGA5软件邻接法(neighbor-joining,NJ)进行DENV基因核苷酸序列系统发生树分析。本研究引用国际基因库(GeneBank)中来自不同国家和地区、不同年代的69株DENVu3000C/PreM区段核苷酸序列,其中Ⅰ型DENV为49株,Ⅱ型16株,Ⅲ型2株,Ⅳ型2株。2病例传播时间12月至9月2.1流行概况及流行特征2013年8月3日,瑞丽市出现首例DF输入性病例,8月30日首例本地感染DF病例被确诊,末例病例发病时间为11月15日,流行期105d。共确诊(实验室诊断)病例232例,其中本地感染145例,缅甸输入87例(46例为缅甸边民来我国就医的患者,其余为中国人在缅甸打工者、商人及旅游者)。2013年瑞丽市DF发病率为124.30/10万,而本地感染病例的发病率则为77.69/10万。疫情波及瑞丽市城区和6个乡镇,以该市城区发病数最多(53.45%,124/232),其次为姐告镇(16.81%,39/232)和勐卯镇(8.19%,19/232),而畹町镇、弄岛镇、户育乡和姐相乡仅各有1例,尚有46例为来瑞丽就医的缅甸居民。月份分布:8月3例(1.29%),9月129例(55.60%),10月86例(37.07%),11月14例(6.04%),12月无病例,主要流行于9~10月,高峰为9月。本地感染病例主要集中在9月和10月上旬,10月下旬~11月几乎没有本地感染病例,而输入性病例贯穿于整个流行期。各年龄组和各职业人群均有发病。2.2u3000DENV核酸检测和序列测定采用RT-PCR试验,选择42例DENV-NS1抗原阳性患者的血清标本进行DENV核酸检测,结果阳性17例,经序列测定获得这17例患者标本的DENV-C/PreM区基因核苷酸序列。17例患者中,本地感染病例16例,输入性病例1例;瑞丽市城区10例,勐卯镇5例,姐告镇2例,均为发生本地流行地区的病例;9月13例,10月4例,均为发病高峰时期的病例(表2)。2.3u3000DENV-C/PrM区的系统进化分析u3000从瑞丽市2013年DF患者急性期血清中获得的17株DENV-C/PrM区基因片段核苷酸序列与来自GenBank中不同国家和地区的69株DENVⅠ~Ⅳ型代表株相应区段核苷酸序列构建系统进化树。图1显示,瑞丽市17株DENV处在各自独立的两个分支,其中5株病毒(RLDEN24、RLDEN29、RLDEN31、RLDEN33和RLDEN36)与登革Ⅰ型病毒(DENV-Ⅰ)同在一个大分支,亲缘关系较为接近,而与登革Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型DENV亲缘关系较远,表明其属于DENV-Ⅰ;12株病毒(RLDEN11、RLDEN16、RLDEN18、RLDEN25、RLDEN27、RLDEN28、RLDEN30、RLDEN32、RLDEN35、RLDEN37、RLDEN38和RLDEN42)与登革Ⅱ型病毒(DENV-Ⅱ)同处一个大分支,而与登革Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型DENV亲缘关系较远,表明其属于DENV-Ⅱ(表2、图1)。根据图1中的DENV-Ⅰ进化分支分析,瑞丽市2013年DENV-Ⅰ流行株聚集在一个相对独立的小分支,它们之间差异较小,为同一个来源的流行株系。进化分析还显示,瑞丽市这5株DENV-Ⅰ(表2)均与泰国(FJ687432、AY732479和HM769967)、缅甸(AY726553)流行株亲缘关系最近,并与越南(JQ045668和JQ045626)和柬埔寨(GU131923和HM631852)流行株也有较近的亲缘关系,而与印度和美洲地区流行株进化关系较远。同样,丽市2013年DENV-Ⅱ流行株也处于一个相对独立的小分支,它们之间仅有微小差异,同属一个流行株系。进一步分析发现,瑞丽市12株DENV-Ⅱ(表2)均与越南(JQ045672)和泰国(FJ810412、GU131886和GQ868544)流行株具有较近的亲缘关系,而与巴西、墨西哥和美国等美洲地区流行株进化关系较远。结果表明,引起本次瑞丽市DF暴发的DENV-Ⅰ和DENV-Ⅱ均来源于东南亚地区。3denv在调查过程中的传播情况东南亚地区是DF地方性流行地区,全年均有病例发生,发病数和死亡数处于较高水平,为全球该病流行最为严重的地区。瑞丽市为中国云南省中缅边境地区的重要沿边开放城市,边境线长168.9km,与缅甸木姐、南坎和九谷市接壤,均为隔江相望,山水相连,自然地理环境极为相似,中缅两国在边境均设有多个口岸,其中瑞丽市姐告口岸为我国连接东南亚和南亚地区的重要陆路通道。出入境人员和交通工具流动性的增强,尤其是两国边民的频繁来往,导致近几年瑞丽市DF输入性病例不断增多,2008年该市曾发生输入性DF暴发并确诊49例登革热。2013年瑞丽市发生了历史上最大的一起登革热流行,在确诊的232例登革热中,缅甸输入性病例占37.50%,本地感染病例占62.50%。输入性病例从8月初开始直至11月每个时段均有发生,而本地感染病例于8月末首先出现,随后病例数快速上升,直至9月下旬开始下降,10月下旬未再发生新的本地感染病例,本地流行基本得到控制。以往报道,缅甸存在4个型DENV的流行,而近几年则以DENV-Ⅰ和DENV-Ⅱ较为常见。2008年本课题组曾在瑞丽市从来自缅甸木姐市(紧邻瑞丽的缅甸边境城市)的输入性病例中检测到DENVⅠ和DENV-Ⅲ,间接证实了木姐市存在这两型DENV的流行。本次对瑞丽市17株DENVu3000C/PrM区基因核苷酸序列分析表明,导致2013年瑞丽市DF流行的病原主要为DENV-Ⅰ和DENV-Ⅱ,证实了当地同时存在这两型DENV的流行。另外,本次瑞丽市流行的DENV-Ⅰ和DENV-Ⅱ分别形成各自相对独立的进化支,并紧密地聚集在一起,表明本次同型流行株之间仅存在非常微小的差异,由此认为,本次DF疫情的病原无论DENV-Ⅰ或DENV-Ⅱ均为同一来源的同一个株系。不同地域DENV流行株存在一定差异,分布具有明显地域性。本次进化分析表明,瑞丽市2013年的DENV-Ⅰ和DENV-Ⅱ均与泰国、缅甸、越南和柬埔寨等东南亚国家的流行株密切关联,由此认为,引起本次DF暴发的病原均来源于东南亚地区。流行病学调查发现,瑞丽市2013年所有的DF输入性病例均来自缅甸,且首例本地感染病例出现之前就有来自缅甸的多例输入性病例,而9月上旬仍然有较多的输入性病例进入瑞丽,本次还从来自缅甸的1例输入性病例血清中检测到DENVⅠ(RLDEN29)。因此,研究显示,2013年瑞丽市本地DF流行与来自缅甸的输入性病例密切相关。因DF患者在发病前1d和发病后5d内为病毒血症期,而输入性病例在病毒血症时期一旦被当地媒介伊蚊叮咬吸血,即可感染和传播DENV。此前调查证实,白纹伊蚊在瑞丽市广泛分布,而埃及伊蚊最早于2004年首先发现于瑞丽市姐告口岸,随后该市其他地区以及相邻的陇川县和芒市的局部地区也发现该蚊。2013年监测表明,该蚊在DF本地流行地区即瑞丽市城区及近郊、姐告和勐卯镇均有分布,而这些包括城区、城郊及边境口岸的地区是相互连接并组成瑞丽市的中心