内皮祖细胞移植治疗糖尿病兔下肢缺血的实验研究

内皮祖细胞移植治疗糖尿病兔下肢缺血的实验研究

内陆祖细胞（epc）是血管内皮细胞的前细胞。在胚胎发育之前，通过克隆和分离，血浆岛外的epc发育并形成最原始的血管结构。这个过程被称为血管疾病。过去认为,血管发生仅存在于胚胎时期,近年来越来越多的证据表明,在成年个体中也有少量的EPC,主要存在于骨髓和外周血中。目前开展的骨髓干细胞移植治疗缺血性疾病的研究正是利用骨髓中的EPC形成新生血管的潜能,来促进血管的恢复与形成。众所周知,糖尿病患者中,缺血性疾病的发生率远远高于普通人群,然而,该治疗手段对于糖尿病患者是否有效尚不清楚。为了探讨糖尿病动物骨髓来源的EPC治疗缺血性疾病是否有效进行了本项研究。1对象和方法1.1实验动物、体重、体重、血糖2006年1月至9月哈尔滨医科大学附属第二医院内分泌科选取健康日本大耳白兔30只(购于哈尔滨医科大学实验动物学部),体重2～2.5kg,血糖≤7mmol/L。随机分为3组,其中糖尿病磷酸盐缓冲液(PBS)对照组8只(A组)、糖尿病EPC移植治疗组14只(包括Brdu标记6只,B组)、正常血糖EPC移植治疗组8只(C组)。1.2体重剂量设计及血糖检测日本大耳白兔禁食24～48h后,临时配制的3%四氧嘧啶(Sigma公司),按80mg/kg体重剂量由耳缘静脉缓慢注射,30s内注射完毕。72h后,血糖仪(罗康全,德国)检测血糖,血糖≥16mmol/L建模成功。以后每周测定血糖1次,当血糖<16mmol/L时按原剂量追加3%四氧嘧啶,直至血糖≥16mmol/L。本研究建模成功率为100%。1.3右后期皮肤注射采用股动脉切除术,对3组日本大耳白兔建立后肢缺血模型。日本大耳白兔经1%戊巴比妥钠(30mg/kg)耳缘静脉注射麻醉后,固定于手术台上。备皮、消毒后肢,无菌条件下,右后肢自腹股沟韧带至膝关节做一垂直纵行切口,沿股动脉走行长轴切开皮肤,钝性拨离出股动脉全程,用丝线结扎髂外动脉远端、股动脉远端及股动脉分支,然后切除股动脉。术后以胰岛素注射器(美国BD公司)在对照组右后肢局部注射20μLPBS;移植组右后肢局部注射含有2×106个EPC的20μLPBS。缺血局部共注射6个点,最后逐层关闭切口,缝合皮肤。术后严密观察,每天注射青霉素(8万U/只),连续注射3d,预防伤口感染。1.4细胞培养和转染参见文献、。所取动物麻醉后,暴露左侧胫骨,以含有肝素盐水的注射器抽取胫骨骨髓5mL,加入到淋巴细胞分离液中,2000r/min,离心20min,分离单个核细胞后,转入含PBS的10mL无菌离心管中,5倍体积的PBS洗涤3次,以每平方厘米接种5×106个EPC接种于培养瓶原代培养。使用M199诱导培养液[M199基本培养液,血管内皮生长因子(VEGF)10ng·mL-1,碱性成纤维细胞生长因子b(FGF)2ng·mL-1],于37℃5%二氧化碳的饱和湿度培养箱中培养。4d后首次换液,去除悬浮细胞。以后每3d换液1次。1.5荆豆凝集素fic-uea-i,acldl-dii,世界面为10gml的细胞系统细胞与Dii标记的乙酰化低密度脂蛋白(acLDL-Dii,10μg·mL-1)37℃孵育24h后,加2%多聚甲醛固定细胞10min,用PBS浸洗,加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荆豆凝集素(FITC-UEA-I,10μg·mL-1),37℃下孵育2h,多波长激光共聚焦显微镜下观察,FITC-UEA-I和acLDL-Dii双染色阳性细胞为正在分化的EPC。1.6细胞培养brdu在培养液中加入5-溴2-脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo2-deoxyuridine,Brdu,Sigma公司),浓度为30mmol/L,于细胞培养第7天换用加入Brdu培养液,培养48h后,细胞移植。取B组6只动物接受标记细胞的移植。1.7石蜡切片的制作B组接受Brdu标记细胞的动物,于术后第3,7,14天,收集接受Brdu标记细胞移植的肌肉组织,制成石蜡切片。通过抗Brdu单克隆抗体(Sigma公司)免疫组化染色,监测置入兔缺血后肢的EPC在体内情况。1.8手术第14天测量以下指标1.8.1免疫组化染色动物肌肉制成横切面石蜡切片后,抗Ⅷ因子相关抗原(1∶150,迈新公司)免疫组化染色。在光学显微镜下,每张切片随机取10个不同高倍视野(×400),非肌肉横切面视野排除在外,计数每个高倍视野内毛细血管数。1.8.2血管计数和肌束计数计数每个高倍视野内毛细血管数与肌束数,并计算比值。1.8.3电子天平匀浆法取肌肉组织,于冰盐水中漂洗,去除血污,以干纱布浸干水分后,在电子天平上称湿重。然后将肌肉在匀浆器中剪碎,加入1mLPBS,匀浆离心后收集上清液。酶联免疫吸附(ELISA)法测定VEGF质量分数,以因子质量(ng)/肌肉湿重(g)表示。2结果2.1大团细胞家系形成单个核细胞经96h的体外培养后,有少量细胞贴壁,贴壁细胞呈梭形,弃去悬浮细胞,经PBS浸洗后,加入培养液,继续培养,梭形的贴壁细胞扩增逐渐形成细胞团集落,培养7d可见大团细胞集落形成。糖尿病动物的单个核细胞在体外培养96h后,贴壁细胞相对较少,但形态各组间差异无显著性意义。2.2梭形贴壁细胞团的表征骨髓来源的单个核细胞,经体外培养7d后,形成的梭形贴壁细胞团,经FITC-UEA-I和acLDL-Dii双染色,在多波长激光共聚焦显微镜下观察,均表达阳性,分别呈现绿色和红色荧光。2.3骨髓epc的监测术后第3,7,14天收集的组织切片上,均可见Brdu阳性的细胞存在,位于血管附近,但未见其形成毛细血管。2.4血管密度b组计数Ⅷ因子染色阳性的毛细血管数,A、B、C3组平均每个视野毛细血管数分别为(9.29±1.63),(12.60±2.16),(12.51±1.56)个。B组毛细血管密度显著增多,与A组比较,差异有显著性意义,P<0.05;与C组比较差异无显著性意义。见表1。2.5大鼠毛细管密度b组计算高倍镜视野下血管数和肌束数的比值,A、B、C3组的值分别为0.66±0.05,0.83±0.11,0.90±0.13,其与毛细血管密度结果相符,B组比值明显高于A组,P<0.05,与C组比较差异无显著性意义(见表1)。2.6两组vegf比较A、B、C3组VEGF的质量分数分别为0.22±0.05,0.30±0.07,0.31±0.08,B组VEGF显著高于A组,P<0.05,差异有显著性意义。C组与B组比较差异无显著性意义(见表1)。3糖尿病大鼠epc治疗的作用机制近年来,关于EPC的研究逐渐成为研究热点。EPC是血管内皮细胞的前体细胞,它能通过自身的增殖、分化,发育形成最原始的血管结构,这种新生血管不依赖于原先是否存在有血管内皮,与传统的成年后血管形成方式,即通过血管内皮细胞出芽、分裂、增殖形成毛细血管网完全不同。成年个体中的EPC主要存在于骨髓和外周血中,并在某些因子的作用下动员到缺血区域,参与血管新生。由于EPC增殖分化能力明显高于内皮细胞,所以由EPC形成血管的规模和循环重建的程度明显增大。正因如此,EPC移植为缺血性疾病的治疗提供了希望。糖尿病患者中,缺血性疾病的发生率远远高于普通人群。然而,糖尿病对EPC及移植后治疗效果的影响还不清楚。本研究发现,来源于糖尿病动物骨髓的EPC受到高血糖的影响,增殖能力明显低于血糖正常的个体。然而,糖尿病动物的EPC经体外扩增,达到一定数量后(2×106)进行自体移植,治疗下肢缺血的效果与非糖尿病动物相同。说明高血糖本身可以影响EPC的数量和增殖功能,但是在高血糖的环境中,EPC仍然可以分化为血管内皮细胞,促进血管形成,从而起到改善供血的作用。病理切片结果显示,在EPC移植治疗的下肢缺血的糖尿病动物肌肉中,毛细血管密度与血管数/肌束数显著高于对照组(P<0.05),说明移植后的EPC促进了毛细血管的形成,其机制可能是其在移植部位部分分化为血管内皮细胞,同时,也可能与其表达血管内皮生长因子受体2(VEGFR2),促进了VEGF的趋化,使周围原有的血管内皮增殖有关。Brdu标记细胞结果显示,移植后的EPC存活于血管周围,甚至可见可疑的EPC形成毛细血管,进一步证实了EPC促进血管形成的作用。VEGF是血管内皮细胞特异性的有丝分裂原,具有强大的促进血管生成和通透作用。同时,VEGF也是一种免疫调节因子。已有研究表明,VEGF影响多种血细胞系的分化、发育和增殖。目前,已知EPC表面有VEGFR2存在,说明其功能受到VEGF的调控。本研究显示,治疗组无论有无糖尿病,肌浆中VEGF的含量均显著增高(P<0.05),从侧面说明了EPC的治疗作用。其机