深圳地区传播媒介携带登革热与基孔肯雅病毒病例调查

深圳地区传播媒介携带登革热与基孔肯雅病毒病例调查

广受欢迎的热梨花和基纳病毒（df）和基纳病毒（chukunkaizhangyuna）是由登甲病毒（denv）和基纳病毒（chukuanya病毒（chukuanya病毒）引起的急性寄生虫。传输手段是伊蚊。症状相似，主要是发热、关节疼痛和皮疹，在世界范围内广泛流行。虽然基孔肯雅热病死亡率低,但传染性强［1］;而登革病毒还可引起登革出血热(DHF)/登革休克综合征(DSS),导致约30%~40%的患者死亡［2］,严重危害群众身体健康。深圳是中国的窗口城市,国内国际交往频繁,加上国际旅游的迅猛发展,人员流动性大;地处亚热带,气候温暖潮湿,非常适合蚊虫的生长繁衍,并且探明存在传播媒介白纹伊蚊［3］。2010年9月,深圳市发生了首起本地登革热暴发流行［4］,同年10月,又报告了首次输入性基孔肯雅热疫情(另文发表),一旦有疫情暴发蔓延极易危及本市及周边地区群众的健康。为保障2011年8月深圳市世界大学生运动会的卫生安全,在开展登革热与基孔肯雅热疫情日常监控工作的同时,又组织开展实验室应急监测以及病毒自然感染状况调查,以便掌握疫情动态,做好疫情预测预警,及时控制疾病暴发流行。1病毒rna的提取、鉴定和分析方法1.1监测病例定义可疑病例,即发热(体温≥38℃),伴关节痛、骨痛、皮疹(药物引起的皮疹除外)症状之一或以上者;发热监测病例,即发热(体温≥38℃),排除呼吸道或肠道感染者。应急监测病例包括可疑病例及发热监测病例;疫情监测病例指可疑病例。1.2采样及送检2011年5月20日-2011年8月31日期间,北京大学深圳医院及深圳市龙岗区人民医院每周采集10份符合应急监测病例定义的血液标本送检;每个病例采集静脉血5ml(非抗凝血),4℃3000r/min低速离心分离血清,置于4℃冰箱48h内送检,否则置于-20℃以下冰箱保存。对可疑病例全市医疗机构均须立即采样送检,12h内检出结果。1.4主要试剂与仪器MEM、RPMI-1640培养基、胎牛血清均购自Gibco公司。OneStepRNAPCRKit(AMV,DRR024A)、ExTaqHotStatrVersion酶(DRR006A)、100bpDNALadderMarker(D505A)均购自Takara公司。荧光PCR仪为ABI公司7500型,普通PCR仪为ABI公司9700型。1.5检测方法1.5.1病毒RNA的提取采用美国Roche公司HighPureViralRNAKit提取病毒RNA,具体操作参见试剂盒说明书,取标本200μl提取病毒RNA,最终收集RNA提取液50μl。1.5.2核酸检测所有标本均采用Real-timePCR法进行登革病毒、基孔肯雅病毒核酸检测,分别按照上海之江生物科技有限公司《登革热病毒通用型核酸测定试剂盒(荧光PCR法)》、《基孔肯亚病毒核酸测定试剂盒(荧光PCR法)》说明书操作要求进行。1.5.3IgM抗体检测核酸阴性标本再用ELISA方法进行登革病毒IgM抗体、基孔肯雅病毒IgM抗体检测,分别按照中山生物工程有限公司《登革病毒lgM抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)》、IBL公司《Chikun-gunyaIgMmicro-captureELISA》试剂盒说明书操作要求进行。1.5.4登革病毒分离采用C6/36细胞按常规方法进行登革病毒的分离。1.5.5登革病毒分型检测采用上海之江生物科技有限公司生产的登革病毒(Ⅰ-Ⅳ型)核酸荧光RT-PCR检测试剂盒进行型别鉴定,具体步骤按照试剂盒说明书操作。同时按照文献方法进行逆转录-半套式PCR分型鉴定。引物具体序列见下表1,均由Takara公司合成。先用登革病毒通用引物D1、D2进行一步法RT-PCR扩增病毒RNA中的保守片段,扩增参数为:50℃30min→94℃2min→94℃30s、60℃30s、72℃30s,35个循环,72℃延伸7min。再利用型特异性引物TS1~4和D1进行套式PCR分别扩增Ⅰ~Ⅳ型病毒中的特异性片段,根据片段长度大小分型。Ⅰ和Ⅱ型扩增参数为:94℃4min→94℃30s、60℃30s、72℃30s,35个循环,72℃延伸7min。Ⅲ和Ⅳ型扩增参数为:94℃4min→94℃30s、52℃30s、72℃30s,35个循环,72℃延伸7min。PCR扩增产物在1.5%琼脂糖上电泳,凝胶成像系统观察分析并记录结果。1.6白纹伊蚊幼虫密度指数及带毒监测在流行季节4月-11月份开展伊蚊孳生地的布雷图指数(BI)、容器指数(CI)、房屋指数(HI)监测。将捕获的白纹伊蚊成蚊和幼虫进行低温研磨,收集研磨上清悬液,按照美国Roche公司HighPureViralRNAKit说明书提取病毒RNA,采取Real-timePCR法进行登革病毒、基孔肯雅病毒核酸检测。1.7统计采用EXCEL方法分析。2登革病毒临床分型检测2.2荧光PCR和IgM抗体检测共检测样品267份。基孔肯雅病毒核酸和IgM抗体检测均为阴性;登革热阳性2份,均为疫情监测病例样品。其中,邹某某,33岁男性,5月17日发病,发病后第7d就诊时采样,登革病毒IgM抗体阳性,核酸检测为阴性;孙某某,43岁男性,8月13日发病,发病后第2d就诊时采样,登革病毒核酸阳性,IgM抗体检测阴性。结合流行病学调查,最后确诊2例登革热病例均为输入性病例。2.3登革病毒分离将编号为SZ1144的登革患者孙某某血清标本稀释后接种C6/36细胞单层,于不同时间观察细胞病变情况。在接种后的第3d出现细胞聚集、细胞间质疏松。第4d,出现登革病毒特有的CPE,细胞破碎、融合。第6d,出现登革病毒典型的CPE,病变细胞形成大小不等的空泡和网状结构。为了进一步观察产生细胞病变的稳定性,将第7d收取的病毒标本感染的细胞培养上清液,继续进行细胞传代。在接种后24h,标本即出现CPE,第3d出现典型的登革病毒的CPE。表明所分离病毒产生的细胞病变是稳定的。2.4登革病毒分型检测分别对登革病毒Ⅰ-Ⅳ型标准株、血清标本以及C6/36细胞培养物提取病毒RNA,进行荧光RT-PCR分型,结果登革Ⅲ型出现明显的“S”型曲线峰图,登革Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ型和阴性对照均没有出峰(荧光PCR图略)。同时采用逆转录-半套式PCR进行型别鉴定,用通用引物和型特异性引物扩增后,分别获得511bp的目的带和290bp的DEN-3型特异性带(图1,图2),与预期的分子量相符,阴性对照未见任何条带。未扩增出其他型别的特异带,证实疫情监测病例登革核酸阳性样品为登革Ⅲ型病毒,将其命名为DEN3-SZ1144。2.5蚊媒密度与携带病毒监测2011年深圳市4月-11月布雷图指数波动于0.80~7.17之间,5月布雷图指数最高;容器指数波动于0.48%~7.26%之间;房屋指数波动于1.28%~5.88%之间(表2)。对11批次的白纹伊蚊成蚊和幼虫进行登革病毒和基孔肯雅核酸检测,结果均为阴性。3血清学检测在登革热病人中的安全性检测结果此次监测共采集267份血清样本,病例定义明确,在发病后7d内采集的占98.5%(263/267),均符合采样标准;采集病例年龄分布广泛,以青壮年为主基孔肯雅病毒核酸和IgM抗体检测均为阴性;检测到2份登革热阳性样品,据流行病学调查,结合临床诊断,确诊2例均为输入性散发登革热病例。经过各级卫生部门的通力合作,采取快速杀灭成蚊和清除幼虫孳生地等措施,从根本上控制了疫情,没有发生二代病例。2例确诊病例分别在出现症状的第2d、第7d才去医院就诊;且此次监测的267份样品,在病例发病第2d以后采样的占25.1%(67/267)。这些现象提示群众的就医意识弱,对这些人群的健康知识宣传是控制登革热和基孔肯雅热输入的关键所在,特别是对从东南亚、太平洋地区、非洲等地回国的高危人群,如出现发热、肌肉酸痛、皮疹、白细胞及血小板减少等临床表现,应提高警惕,尽早诊断治疗,以防出现疫情暴发流行。根据登革病毒特异性抗体产生的规律性,首次感染登革热的患者发病5d,大概80%的患者可以检测到IgM,发病后10d大概有99%可以检出IgM［6］。文献报道,联合应用ELISA-IgM抗体检测法和PCR法对登革热病人急性期血清标本检出率可达到84%［7］,荧光PCR在检测登革热病人血清标本敏感性和准确性均较ELISA方法检测抗体好,在发病第2d即可检测出DENV核酸,但是第7d后拷贝数显著降低［8］。此次监测结果显示,31份疫情监测病例样品中,1份登革病毒IgM抗体检测阳性,而荧光RT-PCR核酸检测为阴性,另一份样品结果与之相反,表明这两种检测方法综合应用起到了互补作用。提示我们对发病早期的血清样本,IgM抗体阴性,且同时具有疑似疾病相应的临床症状和流行病史时,必须考虑用敏感特异的方法例如荧光PCR等检测病毒核酸,可以有效减少病例漏检情况的发生。2例登革热输入性病例中,1例血清样品realtimeRT-PCR和逆转录-半套式PCR方法分型检测均为Ⅲ型。2010年深圳市发生了首起本地I型登革热病毒暴发流行,表明深圳肩负着本土登革热疫情与输入性病例疫情双重防控任务。由于不同型别间几乎没有交叉免疫,势必会加大防控压力,这与广州市情况相似［9］。根据深圳市近年来白纹伊蚊生态监测结果表明,成蚊可以全年活动,5月左右为一个高峰,10月左右是另外一个高峰,本次蚊媒监测就选择在4月-11月进行。结果表明白纹伊蚊布雷图指数仅5月和7月高于5,其余月份均在5以下。尽管此次监测从白纹伊蚊样本中未检测到登革病毒和基孔肯雅病毒,且布雷图指数相对较低,但是随着对外开放的扩大,国际商贸、劳务、旅游活动日益频繁,尤其是与登革热和基孔肯雅热发病较多的东南亚一些地区交流增多,登革热和基孔肯雅热输入我市的机会将会增加。因此,不能放松警惕,必须加强人群和媒介监测,尽早发现病人,及时隔离治疗并切实抓好以灭蚊为重点的综合性防治措施,控制传染病的发生和流行。1.3细胞及病毒标准株白纹伊蚊传代细胞(C6/36细胞)由本实验室液氮保存,复苏后用含10%胎牛血清的50%MEM+50%RPMI-1640培养液(含100U/ml青霉素、链霉素),于28℃、5%CO2条件下常规传代培养。登革