刺参精细发育超微结构观察

刺参精细发育超微结构观察

人参是八珍之一。现代药学研究证明,刺参所含有的粘性多糖、皂苷、多肽等对人体生长、增强人体素质、提高抗病能力有一定的积极作用。在我国可食用的海参有20余种,刺参是其中最有价值的一种。刺参不仅是一种海鲜珍品,同时,还是一种天然的保健品,已经成为我国重要的海水养殖品种。刺参的自然分布主要在我国连云港以北的山东、河北、辽宁沿海。在我国,对于刺参的研究始于20世纪50年代,对刺参的受精、发育生物学、生态学进行了研究;20世纪80年代初期,完成了人工育苗技术的研究;90年代成功地进行了刺参的增养殖。目前,刺参养殖已经成为我国北方海水养殖产业结构调整新的经济增长点。然而,由于刺参养殖起步较晚,相应的基础研究相当薄弱,应用现代技术手段开展刺参的基础和应用研究势在必行。研究刺参的精、卵发生过程以及早期发育等生物学问题,对于深入研究人工繁殖调控机理、发生及发育规律、培育优良品种、开展种质资源保护及进行刺参的增养殖具有重要意义。在棘皮动物中,对海胆等的精子发生过程国外已有报道(Tilney1973;Longo1967;Au1998),但对刺参精子发生过程,国内外尚未见报道。本文对刺参精子发生过程的超微结构进行了观察。1睾丸的体外切片观察2005年4～5月(水温14～20℃)即刺参性腺发育期间,在烟台海龙水产养殖场围堰海参养殖池中取1～2龄刺参(Apostichopusjaponicus),解剖取出性腺。用2.5%戊二醛固定、1%锇酸后固定,Epon812包埋,LKB型超薄切片机切片,醋酸铀和柠檬酸铅双染色,日立H-2600透射电镜观察并摄影。扫描电镜样品用吸管吸取少量的精液滴于离心管中,用2.5%戊二醛固定,1%锇酸后固定,丙酮酸梯度脱水,醋酸异戊酯取代,临界点干燥,真空喷金后在S-540扫描电镜下观察。2结果2.1高电子密度基因检测精原细胞数量较少,与基底膜相连接,切片形状大多为长多边形,切面的长径约为10～15μm,短径约为5μm,核为椭圆形,约为5～7μm,核质比大约为2∶1,具有核仁,直径约为1μm,染色质有一定程度的凝集,线粒体数量较多,大致均匀的分布于细胞质中,细胞内具有高电子密度球形颗粒,为前顶体颗粒,这种颗粒将在发育过程中融合成为前顶体。未发现内质网、高尔基体等细胞器结构(图版Ⅰ-1)。2.2母细胞2.2.1小球细胞之裂产生初级精母细胞位于精原细胞内侧,由精原细胞有丝分裂产生,细胞接近椭圆形,直径7～8μm;细胞核大,圆形,直径约7μm;胞质较少,无核仁;线粒体围绕在核膜的周围(图版Ⅰ-2～3)。2.2.2内质网泡型体积小于初级精母细胞,细胞为圆形,直径7μm;核圆形,染色质进一步凝集,尾部横切面呈“9+2”结构,同时出现了内质网泡和高尔基体结构,位于尾部基侧附近,线粒体体积无明显变化(图版Ⅰ-4、Ⅰ-6)。2.3精细胞精细胞体积进一步缩小,直径3～4μm,核圆形,染色质聚集成团块状,线粒体集中于细胞的一侧,此时前顶体颗粒尚未融合(图版Ⅰ-5)。2.4精细胞向精细胞的转化根据顶体的形成及发育过程可人为分为3个阶段:(1)顶部的形状形成期线粒体数量大大减少体积增大,胞内有大量泡状颗粒,前顶体颗粒融合成顶体,移至细胞核的一侧。(2)细胞空间分布核染色质继续浓缩,细胞核为帽状,顶端凹陷处包裹顶体,核几乎占据整个细胞空间,细胞质很少,线粒体融合成巨大的超级线粒体,长椭圆形,嵴明显,此时顶体呈球形,前部电子密度大,后部电子密度较小。顶体处质膜上有胞吐现象,以丢弃多余的细胞质(图版Ⅱ-1～2)。(3)亚顶体腔及亚顶体物质染色质高度浓缩,透射电镜下,核染色质致密均匀,仅有一到数个空泡分布其中,核为帽状。顶体与核之间出现新月形的腔,称为亚顶体腔,含有电子密度小于顶体的亚顶体物质,亚顶体物质是高尔基体分泌的产物(Frank1967)。高尔基体消失,但原高尔基体所在的位置有大量空泡,说明高尔基体已经解体(图版Ⅱ-4)。2.5顶体及顶体的形态结构成熟精子为原生型,外部形态与精子细胞相差不大,由头部、中部和尾部组成,头部圆形,直径约3μ。尾部为典型的“9+2”结构,长约50～60μ。电镜下顶体分为两个电子密度不同的区域,外观为“眼球状”(图版Ⅱ-5)。线粒体融合成一个超级线粒体围绕着中心粒复合体,中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒相互垂直排列组成,后者长轴走向与尾部一致(图版Ⅱ-6～7)。扫描电镜下观察精子头部球形,顶端顶体处略有凹陷,以一圈沟环为界。中部有1条围绕自身一周的凹陷沟,将头部和中部分开(图版Ⅱ-8～9)。3精子在精子细胞发育中的作用3.1从精原细胞与初级精母细胞,细胞体积没有明显的变化。但从初级精母细胞到成熟的精子,细胞体积逐级递减。高尔基体出现于次级精母细胞时期,在精子成熟期裂解为空泡结构。线粒体具有明显的融合现象,精母细胞阶段,线粒体数目多,体积小,形状为圆形。精子细胞阶段线粒体移于细胞的一侧形成线粒体区,在精子的形成过程中逐渐融合成巨大的环状线粒体,位于精子尾部一侧,围绕中心粒复合体,这与Longo等(1969)对海胆Arbaciapunctulata、紫球海胆Strongylocentrotuspurpuratus线粒体的描述相同。具有“9+2”微管结构的尾部在次级精母细胞时期开始形成,海胆纲动物一般在精原细胞时期就出现了鞭毛结构,较一般动物在精子细胞时期形成要早。海参精子细胞核中有明显泡状结构存在(图版Ⅱ-1),栉孔扇贝Chlamysfarreri(任素莲1998),长牡蛎Crassostreagigas(任素莲1998),尼罗罗非鱼Tilopianilotica(尤永隆1998),黄腹角雉Tragpancaboti(温战强1997),红鲤(林光华1982),Xia等(1988)描述家鸡精子中也都有类似结构存在。泡状的原因是因精子的轻度损伤引起,温战强等(1997)则倾向属自然结构。Lewis等(1980)在研究红鲍的精子时也观察到相同的结构,并认为它们是正常结构。值得注意的是海参精子并未发现棘皮动物其他纲如海胆纲(Auetal.1998)所描述的精子核后窝的结构,鞭毛基部的中心粒直接位于核的下部。3.2海参的精子发育具有明显的不同步性,不同个体性腺发育程度差异明显,即使在同一个个体内生精小管的不同区段生殖细胞发育的程度也不同,有的已经出现了成熟精子,有的却仍停留在精原细胞或精母细胞阶段。直至生殖高峰期后,输精小管内充满精子,而生精小管仍有大部分发育至精细胞或精子阶段。从这一现象可以推测刺参属于在一个繁殖季节内可以多次排精的类型。3.3精子在形成的过程当中具有“连体发育”的现象(图版Ⅱ-3),即两个精子细胞的细胞质连接在一起同步发育,这种连体发育可以持续到精子形成中期。三角帆蚌等双壳贝类在精子发生过程中出现“桑椹胚”结构,即多核结构。郭延平等(2002)认为是雄性生殖细胞核分裂之后,胞质分裂不完全,子细胞之间仍有部分胞质相连的现象。刺参精子“连体发育现象”是否为正常现象,目前尚无定论,有待进一步研究。3