广东地区家庭聚集性登革热患者血清中登革病毒的鉴定

广东地区家庭聚集性登革热患者血清中登革病毒的鉴定

登吉热是由登吉病毒（df）引起的一种急性感染疾病，通过蚊子传播。它主要流行于亚热带和亚热带地区。随着世界气温的变化和航空航行的发展，登吉热成为热带和亚热带地区的严重公共卫生问题。登革病毒归属于黄病毒科中的黄病毒属,为单股正链的RNA病毒,全长基因组约11kb,可分为4个血清型(DENV-1、DENV-2、DENV-3、DENV-4)。病毒基因组RNA可分为5’非编码区、结构蛋白编码区、非结构蛋白编码区以及3’非编码区四个部分,结构蛋白编码区和非结构蛋白编码区的基因序列为:5’-C-PreM-E-NS1-NS2a-NS2b-NS3-NS4aNS4a-NS4b-NS5-3’。在本研究中,我们对今年广东的3例家庭聚集性登革热病例进行了血清学检测及登革病毒的培养分离和鉴定,以期为预测广东登革热的流行趋势和进一步研究登革热的发病机制提供病原学依据。1材料和方法1.1同一家庭,不同旅行3名患者均为今年我院8月6日收治的病人,家住广州,来自同一家庭,发病半个月前均没有到过东南亚等登革热流行地旅行。血清标本均为患者入院时所采集的。1.2igg抗体检测胶体金法检测患者血清中登革特异性的IgM、IgG抗体,采用澳大利亚的PanBioBrisbane公司生产的DengueDuoCassette试剂盒,按说明书进行操作。1.3逆转录pcr采用QIAampViralRNAMiniKit试剂盒,分别取3例患者血清140μl提取病毒RNA,得到含病毒RNA液50μl,然后采用TAKARARANPCRKit试剂盒按说明书进行逆转录,取1μl病毒RNA液为模板,加入AMV0.5μl(5U/μl)、MgCl22μl(25mol/L)、随机引物0.5μl(50pg/μl)、5×RT-buffer1μl、加无RNA酶的双蒸水至10μl,按30℃10min,42℃30min,99℃5min,5℃5min的顺序将其逆转录为cDNA,-20℃保存备用。1.4pcr扩增登皮病毒专用段1.4.1巢式pcr内引物及特异性pcr内引物参考Lanciotti等所用的方法,针对C-prM基因区设计四型通用的巢式PCR外引物(D1和D2)及各型特异性的巢式PCR内引物(DENV-1:D1和TS1;DENV-2:D1和TS2;DENV-3:D1和TS3;DENV-4:D1和TS4),各引物序列和扩增片段如下表。1.4.2pcr的表达第一轮PCR:采用TAKARARANPCRKit试剂盒进行,取之前准备好的病毒10μlcDNA液,再加入Taq酶0.25μl(5U/μl)、引物D1和D2各0.5μl(10pg/μl)、5×PCRbuffer10μl、加灭菌双蒸馏水至50μl体系。PCR的反应条件为94℃预变性5min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,共40个循环;最后72℃延伸10min。结束后分别取10μlPCR产物进行电泳分析。第二轮PCR:取上述PCR产物0.5μl为模板,采用TIANGENPCR试剂盒,用登革病毒型特异性的引物进行第二轮PCR,具体方法为:1型登革病毒特异性引物为D1和TS1各0.5μl(10pg/μl),2×MasterMix25μl,加无菌双蒸水至50μl体系;2型引物为D1和TS2;3型为D1和TS3;4型为D1和TS4。PCR的反应条件为94℃预变性2min;94℃30s,55℃30s,72℃30s,共35个循环;72℃延伸10min。PCR产物经1.5%的琼脂糖电泳后,紫外光下观察电泳结果并摄像。1.5细胞培养及血清培养我们对还处于发热期(发病第5天,体温38℃)的一名患者的血清进行了病毒分离培养。方法如下:取我院实验室保存的C6/36细胞株,复苏后进行培养传代,取1ml密度为1×105个/ml的C6/36细胞种于12孔细胞培养板,置于28℃、5%的CO2培养箱中培养(培养液为:DMEM+10%胎牛血清+青链双抗)。待细胞长成单层后吸去培养液,PBS洗2遍后加入稀释20倍的患者血清200μl置于37℃、5%的CO2培养箱种吸附1h,每15min震荡一次,然后吸去血清加入细胞维持液(DMEM+2%胎牛血清+青链双抗)置于37℃、5%CO2培养箱继续培养,板孔设阴性对照。每天观察并记录细胞病变情况。1.6pcr产物的测量序列和环境分析(MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis)进行比对及进化树分析。2结果2.1igm对革兰氏病毒性igm和igg抗体的检测3名患者血清登革IgM抗体均为阳性,而IgG抗体均为阴性。2.2外引物筛选在分别提取3位患者血清中病毒RNA后,逆转录为cDNA作为巢式PCR第一轮的模板,第一轮PCR产物电泳的结果显示,以来自3位患者血清的cDNA为模板,在500bp稍上的位置都出现了一条特异性亮带(图1),其结果和理论预测的外引物扩增片段大小(511bp)相吻合,提示3位患者血清中均存在登革病毒。第二轮PCR分别以第一轮PCR产物为模板进行,PCR产物电泳结果显示,3型特异性引物的产物250bp稍上的位置也都出现了一条明亮的条带(图1),这和理论预测的3型特异性内引物扩增片段大小(290bp)相吻合,提示3位患者感染的是登革3型病毒。2.3现代细胞变化在接种后的第6天,患者血清所接种的板孔内的细胞出现了登革病毒典型的空泡状病变,对照板孔内细胞始终没有出现病变,将有病变细胞培养上清液再转染正常C6/36细胞,细胞可持续出现病变。细胞培养液上清,经病毒基因组提取和巢式PCR扩增,第一轮PCR产物琼脂糖电泳显示了稍大于500bp的一条特异性条带,第二轮PCR产物电泳显示3型特异性引物扩增出稍大于250bp的特异性条带,这与血清登革病毒RNA检测结果相一致。2.4dna序列比对分析用通用引物D1分别对患者血清和病毒培养上清的第一轮PCR产物进行测序,结果显示所测信号特异度高,干扰信号小,所得的3条480bp左右的DNA序列经MEGE4比对分析证实3条序列间同一性达100%,BLAST结果显示其和登革3型病毒的同一性最高。PCR产物测序所得最长DNA片段(481bp)与印度2004年分离的登革3型病毒株(GenBank登录号:DQ323042.1)相同度最高(99%,图2)。2.5型登革3型病毒的进化树构建为初步探讨本次登革3型病毒株的来源,对测序所得的C-PreM基因区481bp片段(暂命名为:Guangdong200908,即图中箭头所指)和其他15个登革3型病毒进行进化树构建,以登革1型、登革2型、登革3型病毒序列各1条作为为外群。其结果显示C-PreM基因区能很好的将4个型别的登革病毒株区分开,而登革3型病毒株都聚在一起,说明C-PreM基因区用于进化树分析(图3)。3登革3型病毒登革3型病毒首先于1956年在菲律宾分离得到,根据病毒膜蛋白E基因区可将其分为5个亚型。目前,登革3型病毒已扩散到包括亚洲、非洲、拉丁美洲等多个地区。广东本次出现的3个登革热病例来自同一家庭,发病前半个月均没有到过登革热流行地。入院时3名患者血清登革病毒特异性IgM抗体检查阳性,而IgG抗体为阴性,说明3名患者均为首次感染登革病毒。RT-PCR及巢式PCR结果表明用3型登革病毒特异性内引物可扩增出特异性DNA片段,PCR产物经测序和比对分析证实患者感染的是登革3型病毒。患者血清病毒培养分离和鉴定的阳性结果进一步验证了以上结论。3例患者血清PCR测序结果比对结果100%的同一性证实3名患者感染的是同一株登革3型病毒,进化树构建结果显示,我们本次分离的登革3型病毒株和2004年印度分离到的登革3型病毒株同源性最高,提示本次广东分离到的登革3型病毒可能和印度株系来自同一祖先;进化树还显示本次序列和我国80年广西登革热患者血清分离到的登革3型病毒株及2007年浙江输入性登革热病例分离到的登革3型病毒株有较大差别,可能它们分别属于不同亚型。由于本次测序片段较短,所以其具体来源及属于何种何亚型还有待于对该病毒株全基因组序列及流行病学资料的综合分析。广东地区地处亚热带,几乎每年都有登革热病例的出现,且4个型别的登革病毒均出现过,其中登革3型病毒早在1979、1980、1981及1982连续4年有过流行,但之后一直没有出现登革3型病毒的流行。广东近十年来流行的主要是登革1型病毒,包括2002和2006年广州的两次大流行均为登革1型病毒所致。本次广州本土出现了登革3型感染的聚集性病例,这就