大鼠下肢深静脉血栓模型的建立与形态学研究

大鼠下肢深静脉血栓模型的建立与形态学研究

深静脉血栓形成（dvt）严重危害着人类的生命和健康。深静脉血栓形成的动物模型是研究深静脉血栓形成发病机制和评价相应治疗方法的重要工具。制备后肢深静脉血栓形成模型的动物和手段有多种,本实验应用下腔静脉和髂总静脉结扎法建立DVT模型,利用此模型从形态学角度研究血栓形成过程中白细胞的作用。1材料和方法1.1分组及分组雄性SD大鼠(体重300g,中科院提供)共72只,随机分为实验组和对照组,每组各36只。两组内再分为术后6h、12h、24h、2d、4d、8d六个时间组,每个时间组6只大鼠。1.2下腔静脉和双侧髂总静脉实验组SD大鼠用苯巴比妥钠(75mg/kg)腹腔注射麻醉后,腹部备皮,经腹白线正中切口进腹,分离下腔静脉下端与双侧髂总静脉(图1),1号丝线结扎下腔静脉和双侧髂总静脉,可吸收缝线双层关腹。对照组除置丝线于静脉周围不结扎外,其余手术步骤同实验组。术后不用抗凝药,动物自由活动、进食。1.3观察指标实验组和对照组手术后6h、12h、24h、2d、4d、8d六个时间点,进行观察取材。1.3.1大鼠双术后颜色和水肿情况观察在模型制备后6h、12h、24h、2d、4d、8d,肉眼观察并记录大鼠双后肢的颜色和肿胀情况。苯巴比妥钠(75mg/kg)腹腔注射麻醉,解剖大鼠,显露双侧股静脉,观察并记录有无血栓形成。1.3.2多聚甲醛和2%戊二醛pbs固定液配制液样品2肉眼观察后,切取髂总静脉结扎线以下至股静脉段(腹壁浅静脉汇入处),标记近、远端,生理盐水漂洗,置于10%的多聚甲醛和2%的戊二醛PBS固定液中。光镜标本多聚甲醛固定后,石蜡包埋切片,行HE染色。电镜标本经戊二醛固定后,包埋切片,染色观察。1.4统计方法股静脉血栓发生率采用χ2检验。2结果2.1双术后水肿实验组:模型制备后即刻,大鼠双后肢,颜色先变苍白,后变青紫,双后肢呈僵硬,双足温度低,6h后,青紫明显,并开始肿胀,双足温度仍低,双后肢活动少,12h,双足变为深紫色,足温上升,活动仍少,至2d后,双足肿胀最严重,但青紫颜色渐退,双后肢活动增加,但尚不能站立。至4d后,双后肢肿胀开始减退,双后肢可站立活动,但行走活动少。至8d,双后肢仍肿胀,站立活动增加。对照组:在所有时间段,双后肢的情况与双前肢无明显差别。手术后6h,已可站立行走,双足无肿胀,颜色、皮温较术前无明显改变。2.2静脉血栓形成组实验组:6h时,股静脉见不完全性血栓形成(图2),发生率42%,静脉内膜未见损伤,12h,股静脉为不完全性血栓多,发生率50%;部分为完全性血栓,发生率为17%,静脉内膜损伤不明显。2d时,股静脉仍为不完全性血栓多,发生率67%,完全性血栓发生率为25%,静脉内皮损伤,部分血管内皮细胞脱落,内皮下层裸露。4d时,静脉血栓发生率92%,多为完全性血栓,见静脉内皮损伤,血栓收缩,与静脉壁粘连。8d时,静脉血栓发生率为83%,完全性血栓为58%,部分新生血管内皮细胞可形成迷路,相互沟通,使股静脉再通。全部时间组未见大鼠后肢溃疡形成或足趾坏死脱落。对照组6h、12h、2d、4d、8d时,多数未见静脉血栓形成(图3)。仅观察到少数股静脉不完全性血栓形成,静脉血栓发生率为0%、8%、17%、0%、8%。静脉内皮未见明显改变。实验组的各时间段与对照组相比较,DVT的发病率差异有显著性意义(p<0.05)。2.3静脉内皮细胞死亡6h、12h实验组股静脉超微结构与对照组相似,2d组见静脉内皮细胞坏死,部分脱落,内皮下层裸露(图4)。在4d组,见白细胞对股静脉壁的粘附(图5),在8d组,见白细胞对股静脉壁的浸润(图6)。3纤维形貌和血管沉积近年来的研究表明DVT的发病率上升,严重威胁人类的健康和生命。1946年Virchow就提出:血流淤积、静脉内皮损伤和血液高凝状态是造成深静脉血栓形成的三大因素,而DVT的实际形成机制是复杂的,是多因素相作用的结果,新近的研究表明:白细胞在静脉血栓形成中起重要作用。动物模型的建立是研究疾病病因及病理生理变化和对新疗效评价的重要方法。本实验通过建立大鼠DVT模型,进行初步研究。Reyers等通过结扎大鼠下腔静脉首先建立大鼠深静脉血栓形成模型,于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉,一般在结扎3h后,结扎线下方血栓形成率为60%～80%,结扎6h后血栓形成率为100%。本研究目的是模拟人类的髂股静脉血栓形成,在预实验中用Reyers的方法制备,发现股静脉血栓发生率并不高,后来加双侧的髂总静脉结扎,才成功制备后肢DVT大鼠模型。结扎导致的静脉血流淤积是本模型静脉血栓形成的主要原因,手术引起的血液凝固性提高也可能是参与因素,这点可以从对照组大鼠发生DVT得到解释。血液淤积,白细胞粘附、向内皮下移行是深静脉血栓形成的重要因素。激活的白细胞损伤内皮细胞;内皮细胞的破坏,一方面使得内皮屏障受破坏,内皮下的基底膜暴露,提供激活凝血系统的界面,导致静脉血栓形成。另一方面,内皮细胞具有的功能受到损害,包括:①合成和分泌血管活性物质增加或减少,血管活性物质代谢障碍,应激产生自由基;②抗凝血和纤溶活性降低,易形成血栓。③内皮细胞的活化能诱导特定基因的表达,如粘附分子(ICAM-1,VCAM-1,P-selectin等)、细胞因子、生长因子及Ⅱ型主要组织相容性抗原等,促进血栓形成。Eppihimer等用重组P-selectin糖蛋白配基免疫球蛋白有效结合白细胞表面P-selectin上的配基,从而抑制白细胞与内皮细胞、白细胞与血小板间的粘附,可达到抑制静脉血栓形成的目的,Wakef