广州市登革热媒介白纹伊蚊的调查

广州市登革热媒介白纹伊蚊的调查

登陆热是由登陆病毒引起的急性传染病，通常在热带和亚热带地区传播。该病传播迅速,常常引起大规模流行,在南亚和东南亚地区短期内登革热发病人数可达数十万甚至上百万。地处亚热带的广州市是我国登革热的主要发生地之一,近十余年来多次发生登革热的暴发、流行,疫情严重时患者人数达数千人之多。虽然本病近年来已引起广泛重视,但是有关登革热在我国亚热带地区发生、流行的来源及特点等方面仍有许多问题值得探讨和研究。为了了解广州市自然界白纹伊蚊携带登革热病毒情况,从2005年开始,我们开展了广州市白纹伊蚊携带登革热病毒情况的调查,首先由各个区县疾控中心定期采集登革热新旧疫点附近白纹伊蚊幼虫标本,然后对这些蚊虫标本进行登革热病毒检测。现将3年来的监测结果报告如下。1材料和方法1.1白纹伊蚊幼虫本从广州市11个行政区的自然环境(包括外环境和民居室内,以登革热新旧疫点为主)里的各种类型积水中采集白纹伊蚊幼虫标本,在实验室用酵母粉人工饲养为成蚊。1.2病毒登格迪布阳性对照用登革热病毒(广州株)由本中心病毒免疫科提供。1.3en公司和tablesybrt-pcr试剂盒TRIzol试剂购于Invitrogen公司,One-stepSYBRGreenreal-timeRT-PCR试剂盒购于TaKaRa公司。1.4cttctctctctgctrtcactgctrtccttgctgcttgctgac3病毒检测采用荧光RT-PCR方法,所用引物为自行设计,其核苷酸序列为:上游引物:5’CTTTCCTCTTTCCTGCTTGCTAAC3’;下游引物:5’ATCCGTGACCATGCTCCTTATG3’。扩增片段位于登革病毒E基因区域。1.5蚊子被检测为携带登陆热病毒1.5.1荧光定量rt-pcr检测参照文献介绍的方法:将蚊虫冷冻麻醉后置于研磨杯中,加入1mlTRIzol试剂研磨后室温静置3min,再加入200μl氯仿,剧烈振荡后静置、离心,吸取上层水相转移至另一离心管。加入等量异丙醇并混匀,室温静置后离心,弃上清;用75%乙醇洗涤,离心后去上清,真空干燥后溶解于20μl去RNase水中,立即进行RT-PCR。采用TaKaRa公司一步法荧光定量RT-PCR试剂盒,在MJ-Research公司荧光定量PCR仪上进行扩增。50μl反应体系中包含:PCR缓冲液25μl,逆转录酶0.5μl,Taq酶1μl,RNA酶抑制剂1μl,上、下游引物各1μl,RNA样品5μl,加去离子水补齐余量。反应步骤为:42℃逆转录15min,95℃预热5min,95℃热变性10s,60℃退火及引物延伸20s,50个循环后结束反应并制作融解曲线。为保证实验结果的可靠性,每次实验均同时设置阳性对照(以广州株登革热病毒核酸为RT-PCR模板)和阴性对照(以纯水为模板)。1.5.2序列分析出现阳性结果的PCR产物送大连宝生物公司进行序列测定,并对测序结果进行序列分析。2结果2.1病毒核酸阳性标本检测2005~2007年,我们采用实时荧光RT-PCR方法总共检测白纹伊蚊标本493批,平均每批大约10余只蚊虫。分别在荔湾区逢源街(2006年8月)、从化市邓村(2007年4月)、白云区云溪(2007年5月)等地检出登革热病毒核酸阳性标本。其中荔湾区逢源街和从化市邓村标本的RT-PCR产物经过序列测定证实为登革病毒Ⅰ型,而白云区云溪标本经实时荧光RT-PCR方法检测为阳性,但未能进行测序鉴定。2005年广州未发生登革热流行,白纹伊蚊标本主要采自广州市城区,以登革热旧疫点为主。共采集蚊虫标本2000余只,没有检测出阳性结果。2006年广州市发生了较大规模的登革热流行,蚊虫标本主要采自登革热疫点附近,共采集蚊虫约2000只,其中在登革热流行期采自疫点荔湾区逢源街的蚊虫中检出1份阳性标本。2007年广州市没有发生登革热流行,仅有一些散发病例。在当年出现首例登革热病例之前分别在采自从化市邓村、白云区云溪的蚊虫中检出2例阳性标本,其中从化市邓村是2006年登革热的主要疫点之一。2.2测序结果荔湾区逢源街标本和从化邓村标本测序结果相同,核苷酸序列为:5’CTTTCCTCTTTCCTGCTTGCTAACTATCATGTGCGGCTCTCCCCCTCGTGTGGTCAGATGGAACGCCAGGGCTGTGGGCAGCAGCATAAGGAGCATGGTCACGGAT3’。核苷酸序列分析:经过BLAST软件进行序列分析,证实该基因序列为登革热病毒Ⅰ型序列。3基于检测结果的登革热病毒在非流行期的发生情况近年来,关于广州地区登革热流行的来源问题,多数报道认为首例病例均为输入性的,本地发生的登革热流行是由输入病例继发引起的。广州市自然界蚊媒中是否长期存在登革热病毒,在没有登革热病例输入的情况下本地是否也可能发生登革热流行的问题,一直没有直接的证据对此作出回答。但是近年来广州市登革热流行病学调查发现,在广州发生的登革热流行存在着同一地点多年反复发生的特点。调查还发现一些登革热患者发病前并无外出史,且在当地也无输入性病例发生。这些现象提示人们,登革热病毒有可能在广州地区已经长期存在于自然界中,并且能在适当条件下传播给人群,造成登革热的暴发、流行。而登革热病毒在蚊虫种群中的经卵传递和经交配传递能力以及登革热病毒在滞育卵中的越冬能力则为这种观点提供了理论依据。广州市曾经在2002年和2003年连续2年分别发生大规模和较大规模的登革热流行,根据有关检测结果,2002~2004年广州地区流行的登革热病毒株同源性完全一致,而与登革Ⅰ型病毒的国际标准株相应序列有95%的同源性。实验结果表明,2002年疫情的登革热病毒延续到2003年的可能性很大。在登革热的非流行期,于野外采集的白纹伊蚊体内检出登革热病毒核酸则为这种观点提供了直