肺结核患者外周血树突状细胞与h细胞的变化及其临床意义

肺结核患者外周血树突状细胞与h细胞的变化及其临床意义

许多患有关节炎的患者具有免疫功能抑制和细胞免疫功能低下。而结核病免疫是树突状细胞(dendriticcells,DCs)激活的、CD4+T淋巴细胞介导的细胞免疫。本研究利用流式细胞术对73例初治肺结核患者外周血DC亚群与T辅助(T-helper,Th)细胞的变化趋势进行研究,以探讨肺结核患者外周血DC变化及其对Th1、Th2细胞的影响。1数据和方法1.1一般数据1.1.1肺痰菌阳性核酸临床资料来源本院2006年至2008年收治的初治(无或抗结核治疗1周内)肺结核73例,其中男45例,女28例。年龄14~86岁,平均37.5岁。患者均符合文献的诊断标准,具有肺结核一般临床症状、X线检查有肺部病灶、痰检抗酸杆菌或培养阳性、痰检阴性者符合痰菌阳性肺结核诊断标准。其中浸润性肺结核41例,结核性胸膜炎13例,粟粒型肺结核9例,糖尿病并发肺结核10例;其中重度肺结核15例。1.1.2性别、年龄胸透正常及近期无结核病接触史的正常体检者。男20人,女10人。年龄20~60岁,平均35.7岁。5μl结核菌素皮试结果为一般阳性或阴性。1.2方法1.2.1采集样品，腹部采集2ml静脉血，在抗凝剂肝素钠抗凝剂中混合1.2.2cd133-dr-percp法检测细胞因子(1)DCs亚群测定标本的处理:取对照与测定两管,分别加入全血100μl,对照管依次加入Lin1-FITC20μl,MouseIgG1-PE5μl,Anti-HLA-DR-PerCP10μl,MouseIgG2a-APC5μl,测定管依次加入Lin1-FITC20μl,CD123-PE5μl,Anti-HLA-DR-PerCP10μl,CD11c-APC5μl。室温避光孵育15min,加入FACS1∶10稀释的溶血素2ml,混匀,室温避光15~20min,依据细胞溶血而定。1300r/min离心5min,弃上清液。加PBS2ml混匀,1300/min离心5min,去上清液。加入PBS500μl重悬,上流式细胞仪检测。(2)流式细胞仪检测DCs亚群:采用Cellquest软件获取分析,FSC/SSC画R1门去除碎片及死亡细胞,在R1门基础上建立一个Lin1/HLA-DR散点图,画R2门,包括Lin1阴性细胞,在R1和R2门基础上建立CD123/HLA-DR及CD11c/HLA-DR图,画R3、R4、R5门,R3是HLA-DR+CD123+的细胞为DC2,R4是HLA-DR+CD11c+的细胞为DC1。1.2.3荧光单克隆抗体facib(1)取肝素抗凝全血200μl,加RPMI-1640培养液200μl混匀,取200μl加1∶1000稀释的PMA10μl,1∶100稀释的Ionomycin10μl,1∶10稀释的Monensin3.4μl,混匀,于37℃5%CO2培养4h或过夜。(2)淋巴细胞表面抗原及胞浆内细胞因子染色:(1)淋巴细胞表面标记:对照管和测定管分别加入培养全血100μl,依次加入CD3-PerCP,CD8-APC荧光单克隆抗体10μl,混匀,室温避光放置15min。(2)溶血:加入FACS1∶10稀释溶血剂2ml,混匀,室温避光15~20min,依据细胞溶血而定。1300r/min离心5min,弃上清液。(3)洗涤:加入无菌无叠氮钠PBS2ml,混匀,1300r/min离心5min,去上清液。(4)破膜:加1∶10稀释的FACS通透剂各500μl,室温避光10min,加PBS2ml,混匀,1300r/min离心5min,弃上清。(5)胞内染色:对照组加入mouseIgG1-FITC、RatIgG1-PE各10μl,测定加入IL-4-PE、IFN-γ-FITC各10μl,室温避光30min,加入2mlPBS混匀,1300r/min离心10min,弃上清。(6)测定:加入PBS500μl重悬,上流式细胞仪检测。(7)流式细胞检测及分析:以CD3+-SSC选定CD3+,为R1门,以R1设门,CD3-PerCP、CD8-APC作图选定CD4+T细胞,为R2门,对照管mouseIgG1-FITC、RatIgG1-PE作图划出阴性区域,再换测定管,测得IFN-γ、IL-4的含量。1.3统计处理数据均以s表示。采用SPSS12.0软件进行统计学分析。两组间比较采用t检验,P<0.05表示差异有统计学意义。2结果2.1th2细胞比例由表1可见,73例初治肺结核患者外周血中DC1、Th1细胞比例较健康对照组显著降低(P<0.01),DC2细胞含量也较健康对照组明显降低(P<0.05),而Th2细胞比例较健康对照组明显升高(P<0.05)。2.2th1、th2水平由表2可见,浸润性肺结核、结核性胸膜炎、粟粒型肺结核3组间DC1、DC2水平比较有下降趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);Th1水平粟粒型肺结核明显低于浸润性肺结核(P<0.05),Th2水平粟粒型肺结核明显高于结核性胸膜炎、浸润性肺结核(前者P<0.01,后者P<0.05)。提示DC1、DC2水平微量变化明显影响Th1、Th2水平。2.3组患者的水平比较由表3可见,糖尿病并发肺结核患者外周血DC1、DC2的水平与无糖尿病肺结核患者比较,有降低趋势,但差异无统计学意义(P>0.05);而Th1水平明显降低(P<0.05),Th2水平显著升高(P<0.01)。2.4疗效患者的dc1、dc2、th2水平比较由表4可见,15例重度肺结核患者经抗结核化疗与微卡治疗3个月后,疗效显著的患者(症状明显改善或消失,肺部病灶吸收良好)DC1、DC2、Th1水平较治疗前明显升高(P<0.05),而Th2水平较治疗前明显降低(P<0.05)。3不同诱导分化对il-4细胞平衡的影响全球大约1/3人口感染结核杆菌,但大多数从来不发展为活动期,这说明宿主免疫能控制感染。DCs在结核杆菌感染的部位不断被招募、摄取、传递、处理抗原并向T细胞提呈。DCs捕获抗原后提供成熟信号,尽管成熟DC的捕获抗原能力下降,但其膜表面有大量的MHC产物及MHC-多肽复合物,表达多种协同刺激分子,并能合成分泌IL-12,增强天然型和获得性免疫反应。调控了Th1和Th2之间的平衡。使多数人能感染结核菌而不发病。许多研究表明,在疾病发作期,机体存在不同程度的DCs亚群数量和功能下降,从而影响病程的进展和预后。随着患者免疫功能的下降,细胞抵抗病原的能力下降,其分泌的IFN-γ减少。由于感染结核杆菌导致APC合成IL-2能力降低,促使DC1诱导Th1细胞的分化能力降低。本研究结果表明,肺结核患者随着疾病的加重,DC1、DC2和Th1细胞水平随之降低,Th2细胞水平反而升高,使得IL-4的分泌增多。有研究认为,IL-4水平升高使疾病可能向重症进展,与结核性空洞形成相关,而Th2细胞分泌的IL-4有促使DC2凋亡的作用,因而DC2的凋亡也随之增高。因此DC1/DC2的诱导分化不同直接影响Th1/Th2的平衡。Th1与Th2细胞分泌的细胞因子可相互作用,调节Th1/Th2的平衡,这对维持机体内环境稳定有重大意义,一旦此平衡失调,则会引起许多疾病的发生与加重。本研究结果表明,肺结核患者外周血DCs亚群及Th1细胞含量均较健康对照组低下。DCs亚群数量下降提示体内存在免疫功能损伤,并伴随损伤的加重抗结核能力下降,其中DC1细胞数量下降提示体内细胞免疫受到损伤,且随着病情的加重而下降更为显著。Th1细胞的分泌也随之改变,有研究认为结核病患者对结核分枝杆菌是以Th1细胞优势为主的细胞免疫抑制,Th1细胞的抑制程度与疾病严重程度相关。而DC2数量下降则预示机体天然免疫受损。15例重度肺结核患者接受抗结核并使用微卡治疗3个月后随访发现,随着患者免疫功能的改善,DC1、DC2、Th1细胞均明显升高,Th2细胞水平明显下降。从而能够快速诱导DC成熟产生大量IL-12,引起Th1细胞分化,抑制了Th2细胞的分化。IL-4分泌的减少也使DC2凋亡减少。因此可以通过对DC1/DC2或DCs前体细胞进行调节,间接调控Th1/Th2平衡,从而调控机体的免疫功能。由于DC1与DC2均起源于体内的多能造血干细胞,成熟DCs存在于外周淋巴组织中。由于外周血中含量极少,且缺乏特异的标记,故研究非常困难,以前DCs的获取方法繁琐而且影响因素多,会影响DCs细胞的功能,本实验直接采用BD公司提供的试剂,利用流式细胞仪直接检测外周血中DCs细胞,能快速准确的检测DC1、DC2的含量,进而为临床提供快而直接的数据,为临床治疗方案的确立提供帮助。对胸膜炎