浅析我国登革病毒疫苗的现状与发展趋势

浅析我国登革病毒疫苗的现状与发展趋势

据报道，生活在亚热带和亚热带地区的40%的人口受到了登格热感染的威胁，尤其是报告的感染病例逐年增加。在过去的50年里,伴随着全球气温的升高,登革热的发病率增加了近30倍,发病的区域已扩展到一些新的国家,并从城市延伸到农村。登革热发病率的猛速增长,使其成为了一个全球性的健康问题。美国过去30年病例报道中,登革热病例就增加了4.6倍,登革出血热病例增加了8.3倍;1997-2007年间,登革热在巴西的案例就有4818件,其中83.6%的案例发生在2007年。迄今,还没研制出一种许可疫苗应用于临床。也正因为如此,除了许多国家和行业外,小儿登革热疫苗行动(PDVI)、WHO和美国军方也开始了紧密合作,希望能够加快研制出一种既安全又有效的登革疫苗。登革热发病的区域主要集中于热带和亚热带地区(如东南亚:泰国、印尼、新加坡和越南;南美洲:委内瑞拉和巴西;中美洲:巴拿马、萨尔瓦、洪都拉斯、多米尼加共和国和尼加拉瓜;西太平洋:柬埔寨、马来群岛等;非洲:索马里赛舍岛和坦桑尼亚),特别是在东南亚和太平洋西部。据相关报道,登革热已成为某些国家儿童住院和死亡的首要因素。在北非和东南亚的国家中,由于不可控制的人口增长使得城乡易感人群不断增加;热带地区国家非托管的城市化进程快速发展给伊蚊提供了一个舒适的繁殖环境;对一次性容器、旧轮胎和一些可以积集雨水或废水的物体等固体垃圾的管理不善给予伊蚊幼虫一个合适的生长地方;各国商务的频繁往来也增加了病原体传播的可能性。种种可能引发登革热感染因素的存在,使得登革热愈来愈受到各国政府和各行业的关注,同时也推动了登革疫苗的研究进程。登革热疫苗开始研制可以追溯到20世纪20年代。当今,疫苗的开发主要包括了活疫苗(如经典的减毒疫苗、定向诱变疫苗、登革热和登革黄热病嵌合体)、灭活疫苗(重组E蛋白亚基和纯化灭活病毒)和NDA疫苗。1dem的结构蛋白登革热是一种由登革病毒(denguevirus,DEN)引起的急性传染病,主要以埃及伊蚊和白文伊蚊作为媒介进行传播,其临床特征常表现为突起高温、头痛,全身肌肉、骨骼和关节疼痛,皮疹,出血倾向及白细胞计数减少,与基孔肯雅热相似。可分为登革出血热(denguehemorrhagicfever,DHF)和登革热休克综合征(dengueshocksyndrome,DSS)。DHF是一种严重类型的登革热,临床表现为高热、严重出血、血小板计算减少、血浆浓缩,病死率高。同时伴有休克表现的DHF称为DSS。DEN属于黄病毒科黄病毒属,有4个血清型(DEN-1、DEN-2、DEN-3和DEN-4),它们的同源序列高达65%~70%,每种血清型都能引起登革热、DHF和DSS。DEM是一种单股正链RNA病毒。其RNA长约10.6kb,包含1个开放读码框(ORF),编码含3个结构蛋白和7个非结构蛋白的包括近35000个氨基酸的聚蛋白前体(NH2-C-prM-E-NS1-NSA-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-COOH)。DEM为球形颗粒,直径约50nm,核心直径约27nm,毒粒包膜的外表面是一些长5~10nm的突起物。每个病毒粒均含有1个单位膜和1个内部核心结构(核衣壳)。E蛋白(约55KDa)是DEM最大的结构蛋白,可介导病毒与易感宿主细胞的吸附和穿入。通过X射线晶体衍射技术,可知道E蛋白是由2个单聚体组成的同源二聚体,每个单聚体可折叠成3个不同的区域,称为结构域Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ区。其中结构域Ⅱ区很有可能参与二聚体的形成及膜整合过程,且被认为是许多黄病毒组和亚组交叉反应的抗原。DEM的4个血清型之间存在着广泛的血清学交叉反应,这种亚组反应性抗原表位不仅存在于病毒的结构蛋白上,也存在于非结构蛋白上。研究表明,结构域Ⅲ区很可能是细胞受体的结合位点,此结构域的突变会引起病毒毒力的减弱和逃避机体的免疫捕获。但同时也有研究表明,E蛋白Ⅲ区对病毒与宿主细胞的结合作用并非具有独立性。减毒活疫苗往往从单一的疫苗,倾向于能模拟机体自然感染,诱导机体免疫而获得较为持久的免疫能力。传统减毒途径是将病毒在非宿主细胞或动物体内连续传代使其减毒。减毒活疫苗是一种活的病毒,能使被免疫的机体产生结构性和非结构性的抗体。借鉴于其他黄科病毒和日本脑炎病毒成功开发减毒活疫苗的经历,用4种血清型的DEM毒株潜在开发成减毒活疫苗,已被广泛认同。通过这种技术,目前,一些候选疫苗正在开发中。1954年,通过用DEN-1免疫小鼠的大脑,首次获得了DEM减毒活疫苗,但不管是后来所采用PDK细胞传代培养产生减毒疫苗,均会使自愿者产生皮疹。不同病毒株的减毒效果不同,细胞传代会使病毒产生不可预测的分子突变,种种问题的存在,阻止了减毒疫苗的发展。目前,通过这种连续传代的方法获得多株减毒株,如有DEN-1的45AZ5减毒株、DEN-2的16681PDK53减毒株和DEN-4的341750Carib减毒株等。华盛顿特区沃尔特里德军事研究所(WRAIR)和葛兰素史克(GSK)将DEM在PDK细胞连续稀释,再通过胎儿恒河猴肺细胞连续传代,最后用于恒河猴的动物实验,目前,WRAIR进行了4个血清型的单价疫苗的人体实验。细胞传代培养获得的毒株因接种的血清型不同而表现出不同减毒效率,传统减毒途径难以把握毒株的减毒效率,减毒疫苗会因减毒效率低或过于减毒而失去其免疫原性,而减毒活疫苗效率高则会引发登革热,因此这种传统的减毒途径难以满足目前对减毒疫苗研制的需要。近年来,反向遗传学技术的成熟发展,基因突变或称为嵌合减毒的技术逐渐取代了传统的细胞传代减毒方法。科学家们猜想,是否能在DEM的基因组中定位插入一段已知片段,干扰病毒的复制转录能力,从而使病毒具有较高的免疫原性和最低限度的免疫反应性。DEM感染性全长cDNA克隆的构建成功和病毒基因组中相关位点的不断深入研究,使得通过缺失或定点诱变来对病毒定向减毒成为可能。然而,目前的许多实验数据表明,解决减毒效率与机体自身免疫之间的平衡问题存在相当大的难度,并且突变株有可能恢复到原来的野生株。机体感染一种亚型的DEM后可以产生对该种亚型病毒的终身免疫能力,出现异型的二次感染会引起更为严重的登革热,甚至出现DHF或DSS。当今,科学家们对DHF的发病机理存在着2种不同的观点;其一,由异型DEM二次感染导致的抗体依赖性增强所致;其二,由病毒毒力改变所致。干扰4种血清型DEM的复制能力可能会导致机体免疫的失衡,产生一些不必要的免疫病理反应。在旅客的调查中发现,初次感染和二次感染DEM引起登革热和DHF的机率很接近,所以流行病学认为对DHF的发病机制还需要进一步研究讨论。对4种血清型DEM复制能力的干扰,会使病毒的感染能力丧失或增加,所以四价疫苗的配方必须克服病毒的感染能力和机体自身免疫的失衡问题。2dem-80e基因的嵌合病毒的重组另一种构建登革疫苗的有效方法就是利用分子遗传学,以黄病毒属家族,如黄热病毒,或以减毒登革病毒株为骨架,再从4种血清型病毒中替换出同源序列(主要是prM-E)的重组嵌合毒株,从而获得合适的减毒效率和较高的免疫原性。作为骨架必须包含DEM的结构蛋白C、非结构蛋白和登革病毒RNA的5′-UTR和3′-UTR。美国NIHNIAID的La等以4型登革热病毒的cDNA克隆为骨架,再将1型、2型和3型登革热病毒的C-prM-E基因替换4型登革热病毒的相应片段,从而获得了登革1-4型、登革2-4型和登革3-4型的嵌合疫苗。随后,将登革1-4型和登革2-4型的嵌合毒株分别或混合免疫恒河猴。结果表明,不论是单价还是混合后对恒河猴的免疫均可诱导产生特异的中和抗体,并能抵抗DEN-1和DEN-2致死剂量的攻击。WRAIR通过截短重组DEM包膜蛋白亚基(80E),并在果蝇施耐德-2(S2)细胞的表达系统中得到高效表达。通过X射线晶体结构分析表明,重组80E亚基的折叠类似于自然状态。之后把重组80E亚基分别克隆到4种血清型的登革热病毒基因组中,并与佐剂配伍后,免疫小鼠并表现出高滴度病毒中和抗体反应。重组后的4种血清型的DEM再进行配伍,获得四价登革疫苗后,免疫小鼠,再分别用4种血清型的DEM进行作用,同样能够得到高滴度的中和抗体。基于在果蝇S2细胞表达系统生产的80E亚基,这些结果促进了四价登革病毒疫苗的发展。目前,在临床试验中做得最为成功的重组嵌合疫苗是嵌合Vax登革减毒疫苗,它是以黄热病毒17D株(YF-17)为骨架,分别将4种血清型的登革病毒的prM-E基因替换感染性克隆相应基因构建了DEN-1/YF、DEN-2/YF、DEN-3/YF和DEN-4/YF嵌合病毒。Aca-mibis公司和Mahidol大学基于DEN/YF嵌合策略构建的4个血清型的嵌合病毒,配伍成四价疫苗。临床试验显示,该四价疫苗在机体内具有良好的免疫原性、很低的反应原性和病毒血症。目前已进入了临床Ⅱ期研究阶段。3dem在登革病毒dna疫苗中的应用登革DNA疫苗主要是将登革病毒的prM-E和NS1作为靶基因克隆到真核表达载体上,然后将重组的质粒直接注射到动物体内,使靶基因在活体内表达,产生抗原启动机体免疫系统,引起免疫反应。4种血清型病毒的E蛋白Ⅲ区基因片段分别克隆pcDNA3质粒的重组质粒,检测在COS-7细胞中的表达情况。每种质粒或四价重组体通过肌肉注射免疫BALB/c小鼠,结果表明,以E蛋白Ⅲ区基因片段制定1个四价DNA疫苗诱导机体产生中和抗体保护。宾夕法尼亚州学校的病理与检验科Mathura等人,通过4种血清型病毒的E蛋白Ⅲ区基因片段分别克隆到含有1个开放读码框的哺乳动物的载体中,称为pDV-U-DⅢ,配伍成四价DNA疫苗。并能诱导小鼠产生对4种血清型的中和抗体,防止细胞受病毒的感染而死亡。DNA疫苗在其他疾病动物模型中虽然表现出良好的免疫应答和免疫保护,但在机体中,即使它们能诱导动物产生细胞免疫反应,但显示出很低的免疫原性。1997年,美国马里兰海军研究中心(NMRC)首次对登革病毒DNA疫苗进行了尝试。他们将DEN-2的prM和E基因(N端92%,去除C端信号肽和跨膜序列)克隆至真核表达载体pVR1012载体构建的重组质粒,以200μg/只的剂量肌肉注射小鼠,可诱导高水平中和抗体(效价为1∶320),但未产生免疫保护。此后,利用同样的质粒系统,他们构建了含有DEN-1prM和完整E基因的重组pVR1012质粒。以1mg/只的剂量分别通过皮下和肌肉途径接种夜猴,亦可诱导产生高水平中和抗体,并可显著缩短病毒血症的时间;采用同型DEM感染,可产生免疫记忆应答。该研究表明,登革DNA疫苗可诱导有效的免疫应答和免疫保护,这也是人类首次在非人灵长类动物中进行的登革DNA疫苗实验。日本神户大学医学院健康科学系Konishi等人,构建包含4种血清型DEM的prM和E基因的表达载体的四价DNA疫苗,免疫BALB/c小鼠,结果使小鼠产生了记忆性的中和抗体,并对4种血清型DEM起到免疫保护。有文献报道称,DEM引起的抗体依赖性增强作用,可能由E蛋白引起。一些以DEM的NS1作为靶标构建DNA疫苗,也存在许多因素影响登革DNA疫苗的免疫效率,比如细胞因子、佐剂、剂量等。很多研究针对提高登革DNA疫苗应答水平进行探索。当中,采用免疫刺激序列和以含有细胞因子的质粒DNA作为佐剂可提高有效刺激重组质粒DNA的免疫应答水平。但最新研究表明,当曾感染过DEM的人,在初次感染后产生的prM-E蛋白抗体会在异型二次感染再次被激活并发挥作用,但它们不但无法保护身体免受二次感染,反而会帮助病毒进行复制,促使病毒去感染更多的正常细胞。有关研究表明,登革DNA疫苗既能诱导体液免疫,也能诱导细胞免疫。可目前的研究基本上没对登革病毒DNA疫苗诱导的细胞免疫进行深入分析。还有相关研究表明,尽管针对prM-E基因的重组诱导的中和抗体水平低,但依然产生部分保护效果,重组质粒诱导的细胞免疫应答在产生免疫保护中也具有重要的作用。4免疫能力的研究近年来,登革疫苗的研究已取得了可观的进展,四价减毒活疫苗和四价DNA疫苗已进入或有望进行临床研究,但仍然存在许多问题需要解决,包括DEM感染致病机制目前尚不清楚,没找到合适的动物模型,DEM毒力大少的决定因素不清楚,实验数据与临床数据的不吻合,除NS1的功能外,DEM其他非结构蛋白的结构和功能知之甚少等等。这些问题的存在将会阻碍登革疫苗的研究发展。而且,必须制定新的策略以确保登革疫苗在后期临床试验阶段的安全可靠性。在机体被DEM感染后获