花椒中游离脂肪酸的微波提取及衍生化hplc荧光检测

花椒中游离脂肪酸的微波提取及衍生化hplc荧光检测

青椒是科的一种体裁，属于“八味”之一。全世界花椒品种约250种,我国约有39种14变种。作为一种重要的香料和药用经济作物,花椒种植规模每年以20%~30%的速度递增,其综合深度开发前景广阔。在食品科学中,游离脂肪酸(FFA)含量水平不但是食品品质的一项重要指标,而且对食品风味形成作用很大。因此,开发花椒FFA快速、高灵敏的提取和分析方法,对花椒原材料、生产加工以及相关产品质量控制和研究开发具有重要意义。脂肪酸的提取方法有索氏法、溶剂法、超声波提取、超临界提取以及微波辅助提取法等。其中,微波辅助提取法具有提取时间短、溶剂消耗低、提取效率高,且易于操作和节能等优点,具有很大优势。脂肪酸的分析方法较多采用甲酯化气相色谱-质谱法,其优点是可进行数据库检索,缺点是甲酯化衍生反应稳定性差。虽有报导HPLC-MS直接检测,但脂肪酸的质谱离子化效率低,导致灵敏度和适用性有限。衍生化HPLC荧光检测法具有较高灵敏度,已报导的荧光衍生试剂大多存在不同缺点,如稳定性差、灵敏度低、操作繁琐、分离干扰严重等。国内报道了2-(11H-苯[a]咔唑)乙基对甲苯磺酸酯(BCETS)和苯并[b]吖啶酮-5-乙基对甲苯磺酸酯(BAETS)用于羧酸化合物分析,具有衍生效率高、产物稳定、操作简便、易于分离等优点。本研究建立了微波辅助快速提取花椒FFA的技术,并建立BAETS柱前衍生HPLC荧光检测分析方法且进行检测,为以花椒FFA作为品质评价指标提供参考依据,为花椒及其相关产品的质量控制标准提供技术支持。1材料和方法1.1试剂与仪器花椒样品购自北京亚威中药饮片有限公司(红花椒,产品批号120801,产地四川),50℃恒温鼓风干燥箱烘至恒重后,用粉碎机粉碎,过60目筛密封保存待用,本研究中所用花椒样品均来自这同一份均一的粉碎样品;石油醚、甲醇、乙醇、氯仿、正己烷等均为分析纯,购自天津科密欧化学试剂有限公司;N,N-二甲基甲酰胺(DMF)购自国药集团,经减压蒸馏后使用;10种不饱和脂肪酸标品Sigma;9种饱和脂肪酸标准品上海试剂厂;色谱纯乙腈德国Merck公司;其他试剂皆为分析纯;纯水Milli-Q超纯水系统制备;苯并[b]吖啶酮-5-乙基对甲苯磺酸酯(BAETS)衍生试剂为合成,纯度>99%,由曲阜师范大学化学与化工学院尤进茂教授研究组制备。Agilent1100型高效液相色谱-质谱联用仪Agilent公司;IKAA11型食品粉碎机广州仪科实验室技术有限公司;BF-2000型氮气吹干仪北京八方世纪科技有限公司;XH-100A型微波催化合成/萃取仪北京祥鹄科技发展有限公司。1.2实验方法1.2.1baet衍生试剂和脂肪酸混标的制备准确称取脂肪酸标品,配成0.01mol/L乙腈溶液。称取适量BAETS衍生试剂用DMF定容至10mL,浓度0.01mol/L,低浓度衍生试剂和脂肪酸混标分别用DMF和乙腈稀释使用。1.2.2脂肪酸衍生反应BAETS对FFA的衍生按最优化条件进行:在含10mgK2CO3的2mL安培瓶中依次加入200μLDMF,50μL混合脂肪酸(1.0×10-4mol/L),100μL衍生试剂溶液,封口后90℃水浴振荡反应30min,放置冷却到室温后,过滤膜并适当稀释后进样分析。该衍生液中脂肪酸标品进样10μL,液相色谱荧光分析的进样量为142.86pmol,依次稀释进样测定,在142.86~0.139pmol范围内进行线性回归,制作标准曲线,以此实现对花椒样品中FFA定量测定。1.2.3微波提取衍生测定对微波提取技术进行了提取溶剂、温度、时间、功率的优化考察,以建立快速有效的提取方法。简要步骤如下:称取0.2g上述花椒样品,放入100mL的三口圆低烧瓶中,加入25mL氯仿/甲醇混合溶液,放入磁子,连接好控温探头和冷凝回流装置,设定微波提取功率700W,温度70℃,提取时间10min,待恢复到室温后称定质量,精确移取过滤膜的提取液0.5mL于试管中,氮吹仪吹干后,用500μLDMF溶解用于衍生测定。1.2.4dmf的制备微波提取的样品用优化的衍生方法测定,保证使FFA被定量衍生。向盛有10mgK2CO3的2mL安培瓶中依次加入200μLDMF,100μL提取的DMF溶液,100μL衍生试剂溶液(0.01mol/L),封口后于90℃恒温水浴下振荡反应30min,取100μL衍生液稀释后进样分析。1.2.5荧光定量和柱洗脱程序液相色谱条件:色谱柱为EclipseXDB-C8色谱柱(4.6mm×150mm,5μm,Agilent)。流动相A为50%乙腈水溶液(含10mmol/LHCOONH4,pH3.8),B:100%乙腈,C:乙腈(含0.2%甲酸)。流速1.0mL/min,进样量10μL,柱温30℃。荧光激发和发射波长分别为:λex=273nm,λem=505nm。梯度洗脱程序见表1。质谱条件:大气压化学电离源(APCI),正离子模式,喷雾压力413kPa,干燥气流量为5L/min,干燥气温度350℃,气化温度450℃,毛细管电压3500V,电晕电流4000nA(Pos)。2结果与讨论2.1催化剂的衍生化效果FFA与BAETS的衍生反应需在弱碱性有机溶剂环境中进行,随溶剂不同产率有显著差异。参照以往衍生化反应的优化方式,首先考察了碳酸钾、草酸钾、酒石酸钾、柠檬酸钾和醋酸钠的催化效果,结果表明,使用10mgK2CO3做催化剂具有最高衍生产率,这与以往的研究报道相同。分别选取乙腈、DMF、四氢呋喃、二甲亚砜作为衍生溶剂体系进行考察,结果表明,DMF具有最大衍生化产率,且副反应少。随衍生温度升高和时间延长,等量FFA衍生产物的峰面积会逐渐增加,在90℃反应30min后衍生产物信号几乎不再增加,因此,本研究统一选取90℃衍生反应30min。2.2高效液相色谱条件优化游离脂肪酸BAETS衍生物的色谱分离的难点在于多种长链不饱和脂肪酸与略低碳数的饱和脂肪酸出峰时间较为集中,给色谱分离带来较大困难。在优化初期,对比不同色谱柱和色谱条件,总有两对FFA衍生物(C22∶6和C14,C18∶2和C15)难以彻底基线分离。从上述色谱柱中挑选最优的EclipseXDB-C8色谱柱,再进行色谱条件优化,发现在流动相中添加pH3.8的甲酸铵缓冲液,提供弱酸性流动相环境,能够改善前半部分的脂肪酸衍生物的峰形和分离度。然而,后半部分衍生物柱上保留较强且分离度不高,在流动相C中添加0.2%甲酸后,明显增强了流动相的洗脱能力且改善了后半部分脂肪酸衍生物的分离度,得到了能够满足外标法定量的分离结果,19种标准脂肪酸衍生物色谱分离见图1。图中前10min是BAETS在K2CO3作用下分解出的杂质峰,不干扰后面FFA衍生物的分离和测定。同时,采用在线质谱进行辅助鉴定,质谱条件采用实验部分所列参数即可得到很好的质谱信号。2.3青椒提取条件优化为建立快速有效的花椒FFA微波提取方法,考察了提取溶剂、微波功率以及时间和温度的影响,在提取过程中一直开启电磁搅拌功能。2.3.1样品含量和提取率测定对微波辅助提取花椒FFA的溶剂进行了对比,在其他条件相同的情况下,考察石油醚、甲醇、乙醇、氯仿、正己烷、氯仿/甲醇(2∶1,1∶1,1∶2,V∶V)。设置温度探头70℃即可实现上述溶剂回流效果,提取和FFA测定按照实验部分方法进行。结果表明,不同溶剂提取的FFA种类基本无差别,但提取率明显不同。将每种溶剂提取所得游离脂肪酸BAETS衍生物的峰面积总和进行比较,如图2所示,纵坐标值为每种溶剂体系所得脂肪酸总峰面积与提取率最高的氯仿/甲醇(1∶1,V∶V)总脂肪酸峰面积之百分比(%)。本研究采用氯仿/甲醇(1∶1,V∶V)作为微波提取FFA的溶剂。2.3.2微波功率对ffa衍生物峰面积的影响选用氯仿/甲醇(1∶1,V∶V)作为提取溶剂,在其他条件相同的情况下,对微波提取功率进行了对比考察。按照实验部分的提取步骤进行,在300~1000W范围内发现随着提取功率的增加,可以在更短时间内完成提取。在提取时间为14~18min时,400~500W即可达到几乎完全提取的效果,如果增加提取时间,在更低功率下仍可实现较高提取率。本研究目的是建立一种快速高效的提取方法,因此将提取时间定在10min进行考察。为达到花椒FFA的最大提取率,以900W提取两次(每次10min,两次峰面积之比为98.9∶1.1)的FFA衍生物峰面积总和作为完全提取的标准对照值,将每个功率下的峰面积与之对比作为纵坐标值(%),如图3所示,当提取时间为10min时,微波功率在700~900W范围内能够达到接近100%的提取率(均>98.2%),按照节能原则,实验选用700W微波功率。因此,本研究最优化微波提取条件为:采用氯仿/甲醇(1∶1,V∶V)作为提取溶剂,700W功率提取10min即可完成。2.3.3ffa总峰面积的测定为验证上述最优化条件的有效性,采用上述最优化条件,以氯仿/甲醇(1∶1,V∶V)作为微波提取溶剂,功率700W提取10min,连续提取3次,分别测定每次所提取出的FFA总峰面积,3次的脂肪酸总峰面积之比为98.6∶1.1∶0.3。因此,上述最优化条件第1次提取率达98%以上,可认为达到了完全提取。2.4ffa衍生物线性回归方程在线性范围142.86~0.139pmol(进样10μL)范围内,依据峰面积和实际进样量(pmol)进行线性回归,各FFA衍生物的线性回归方程﹑相关系数和检出限见表2。线性相关系数在0.9994~0.9999之间,检出限在6.36~33.67fmol之间(S/N=3∶1)。2.5方法研究2.5.1色谱分析稳定性将添加适量标准品的花椒粉末按照上述最优微波提取条件进行提取,并按照实验方法进行衍生和测定,衍生产物分别在室温0、4、8、12、24、72h时进行色谱分析,峰面积的相对标准偏差(RSD)均低于2.90%,表明该方法具有较好的精密度,游离脂肪酸BAETS衍生物的稳定性良好。2.5.2重复性检验取同一批6份上述加标后提取的样品,进行样品处理并进行重复性检验。结果显示,重复性检验的峰面积相对标准偏差(RSD)为6.28%,表明本方法具有较好的重复性。2.5.3柱前衍生hplc荧光检测在已知各FFA含量的花椒粉末样品中,加入10μL混合脂肪酸(每种浓度1.0×10-4mol/L),按照提取和分析方法进行测定,计算各脂肪酸的回收率在87.60%~106.59%之间,这表明本研究建立的微波提取和柱前衍生HPLC荧光检测法具有良好的准确性。2.6油酸衍生物的组成采用上述建立的微波快速提取法和BAETS衍生化HPLC荧光检测法进行定量测定,同时进行在线质谱辅助鉴定,这为HPLC荧光定量提供了更高的准确度。花椒样品中FFA含量结果见表3,样品中FFA衍生物的色谱分离见图4(A),代表性的油酸衍生物的一级质谱图为图4(B),二级质谱图及其裂解模式归属见图4(C)。结果表明,该花椒样品中共检测出9种FFA,其中油酸(C18∶1)、亚油酸(C18∶2)、棕榈酸(C16)和硬脂酸(C18)是花生油中的最主要的FFA成分,相对含量最高的是油酸,含量高达33.29%(374.09μg/g),依次是亚油酸(30.36%),棕榈酸(18.70%)和硬脂酸(5.90%)。其中,不饱和脂肪酸占总FFA的70.75%,多不饱和脂肪酸占总FFA的33.96%(主要是亚油酸和α-亚麻酸,二者是人体不能自身合成的必需脂肪酸),因此,花椒FF