海洲湾钢养殖牡蛎腹泻性毒素监测

海洲湾钢养殖牡蛎腹泻性毒素监测

近年来，沿海水体的潮平面打破了水生生态平衡，限制了浮游生物和底栖生物之间的依赖关系，损害了生物食物链的正常循环。赤潮生物体内或代谢产物中含有生物毒素，不仅直接毒死鱼、虾等生物，而且赤潮毒素通过食物链的传递，危害人类的健康。常见赤潮毒素有5类：麻痹性贝毒（Paralyticshellfishporsonmg,PSP）、神经性贝毒（Neurotoxicshellfishpoisoning,NSP）、腹泻性贝毒（DiarrheticShellfishPoisons,DSP）、记忆缺失性贝毒（Amnesicshellfishpoisoning,NSP）和西加鱼毒（Cigusterafishpoisoning,CFP），其中以麻痹性贝毒和腹泻性贝毒在世界范围内分布广、危害大而受到重视。腹泻性贝毒素（DiarrheticShellfishPoisons,DSP）是一种脂溶性毒素，被人食用后产生以腹泻为特征的中毒效应。目前已发现的腹泻性贝类毒素大致可分为3类：软海绵酸（Okadaicacid,OA）及其衍生物鳍藻毒素（DTX）、大环内脂扇贝毒素（PTX）和磺化毒素（YTX）及其衍生物。毒素的检测分析方法主要有生物分析法、细胞毒性分析、免疫分析和化学分离法。免疫分析包括放射免疫分析（RIA）和酶联免疫分析（ELISA），具有选择性高、灵敏度好、专一性强的特点。试验选择酶联免疫分析方法，通过比较2010—2012年海洲湾海域赤潮监控区、增养殖区、趋势性监测区牡蛎腹泻性毒素检测结果，探讨酶联免疫法在贝毒检测中的实际效果，以及贝毒与有毒赤潮的相关性应用。1材料和方法1.1均质物的制备样品采集于2010、2011、2012年海洲湾海域赤潮监控区、增养殖区、趋势性监测区的新鲜牡蛎。经洗净、沥干、去壳后，取可食部分用高速匀浆机制成均质物，备用。腹泻性贝毒标准品为伊普瑞斯科技有限公司E-OA-C100型。冈田软海绵酸检测试剂盒为荷兰EURO-PROXIMA公司产品，试剂盒为96微孔板，标准溶液浓度分别为0,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0ng/mL。实验用水为超纯水。甲醇为美国天地公司色谱纯（100%）。检测酶标仪为美国伯乐公司Bio-rad680型。1.2清液的制备称取1.0g检测样品均质物，加入1.0mL超纯水，涡旋混合1min，加甲醇2.0mL，涡旋混合1min,2000r/min离心10min。收集上清液，0.45μm滤膜过滤。滤液用样品稀释缓冲液50倍稀释，充分混匀后吸取50μL为样品检测液。1.3检测样品前处理微孔板从上到下依次设置为A～H,A为空白，B～H为标准溶液系列浓度。A孔加零标准溶液100μL,B～H孔依次加标准溶液50μL，浓度分别为0,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0ng/mL，分别加入酶结合物溶液25μL和抗体溶液25μL。其余各孔分别为经过前处理的牡蛎检测样品。所有标准溶液和检测样品均同时设平行组2个。薄膜封板，摇板1min，室温20～25℃，暗处温育30min。弃去孔中的液体，用洗涤缓冲液冲洗板孔，吸水纸上拍干，重复3次。各孔分别加底物溶液100μL，室温20～25℃，暗处温育15min。再加入终止液100μL。以空气为空白，酶标仪450nm处读取吸光值。1.4标准曲线的建立将标准品和样品的吸光值减去空白值，结果除以零标准吸光值，再乘以100。以得到的系列比值为Y轴，X轴上的浓度对数构建标准曲线，在0.2～10.0ng/mL范围成线性。利用试剂盒公司提供的数据分析软件绘制出标准曲线，并乘以稀释倍数计算出各个样品的腹泻性毒素浓度。1.5贝毒标样的检测检测样品中分别添加浓度为1.0,3.0和5.0μg/kg腹泻性贝毒标样。按照样品的前处理方法同时进行前处理，测定腹泻性贝毒的含量，计算回收率。每隔10d，进行3个批次样品的处理和测定，并计算回收率。2结果2.1标准曲线标准曲线直线方程y=a+bln(x），其中a=64.7,b=-20.28。相关系数R2=0.9914（图1）。2.2不同时期牡蛎腹泻性毒素含量比较2010年赤潮监控区、增养殖区和趋势性监测区牡蛎腹泻性毒素含量分别为20.9～74.5μg/kg,21.3～34.8μg/kg和30.1～39.8μg/kg，以趋势性监测区为最高。3个不同监测区的检出率分别为83.3%，83.3%和80.0%，9月份检出率高于8月份（表1）。2011年赤潮监控区、增养殖区和趋势性监测区的牡蛎腹泻性毒素含量分别为25.3～50.6μg/kg,20.6～52.5μg/kg和30.1～39.8μg/kg，以赤潮监控区为最高。3个不同检测区的检出率分别为100.0%，50.0%和50.0%，8月份的检出率高于5月份（表2）。2012年赤潮监控区牡蛎腹泻性毒素含量为15.8～35.6μg/kg，检出率为66.7%。增养殖区牡蛎腹泻性毒素含量未检出（表3）。2.3回收率及批内变异系数腹泻性贝毒以1.0,3.0和5.0μg/kg在检测样品添加后，平均回收率分别达到88.0%，86.7%和88.6%。批内变异系数分别为1.60%～2.46%，1.81%～2.66%和1.44%～4.60%。批间变异系数分别为3.38%，3.08%和3.98%。3减少牡蛎腹泻性毒素，降低赤潮放出率，减轻企业回收率赤潮是一种海洋灾害，已引起沿海国家的高度重视，严格控制污水和污染物的入海量是比较有效的防治措施。赤潮对生物资源的影响已成为联合国有关组织所关注的全球性问题之一。在防范赤潮工作方面，建立了赤潮防治和监测系统，对有迹象出现赤潮的海区，进行连续的跟踪监测，及时掌握引发赤潮环境因素的动向，为预报赤潮的发生提供信息，对发生赤潮的海区采取必要的防范措施。2010—2012年，在海洲湾海域赤潮监控区、增养殖区和趋势性监测区共检测42个养殖牡蛎样品的腹泻性毒素。腹泻性毒素含量由2010年的20.9～74.5μg/kg，逐渐降低到2011年至20.3～52.5μg/kg和2012年的15.8～35.6μg/kg。连续3年养殖牡蛎检测样品中腹泻性毒素平均检出率分别为82.4%、66.7%和57.1%。从养殖牡蛎检测样品中腹泻性毒素含量和检测率逐渐降低的情况分析，加强海洋环境保护，控制沿海废水废物的入海量，特别要控制氮、磷和其他有机物的排放量，对控制赤潮的发生起到了一定的效果。应用酶联免疫法检测养殖牡蛎腹泻性贝