扁穗牛鞭草减数分裂期胞质异常分析

扁穗牛鞭草减数分裂期胞质异常分析

c-hematachirep.br.是水稻科的一种多年生草本植物，主要分布在热带和亚热带地区。作为典型的暖季型禾草,扁穗牛鞭草具有强大的克隆繁殖能力,但有性生殖能力弱,野生或人工栽培条件下结实率很低[1~3],这就限制了扁穗牛鞭草的进一步推广应用。对此,国内外学者从不同角度进行了大量研究[4~9]。傅鲜桃等研究发现,‘广益’扁穗牛鞭草已萌发的花粉管尖端分叉、盘绕在柱头表面及尖端膨大等异常现象对自交亲和性有很大影响;陈灵鸷等认为,温度、湿度等外界因子对扁穗牛鞭草柱头可授性影响较大;此外,研究表明花粉散布特性与专性远交繁育系统之间的矛盾也会影响扁穗牛鞭草结实率。但关于限制扁穗牛鞭草结实率的生殖生物学因素的研究较少,本研究以不同倍性扁穗牛鞭草为研究对象,采用常规石蜡切片法和光学显微技术对小孢子发生与雄配子发育进行研究,利用常规压片法对小孢子母细胞减数分裂过程进行观察,以期为扁穗牛鞭草的生殖生物学研究提供基本资料,也为探求扁穗牛鞭草天然种群结实率低的胚胎学因素提供科学依据。1材料和方法1.1试验材料供试材料种植于四川农业大学草学基地,分别为扁穗牛鞭草四倍体野生材料H052和六倍体栽培品种‘广益’。1.2测试方法1.2.1未制备织物5份2009~2011年每年7月中下旬至8月下旬,于扁穗牛鞭草抽穗期采集不同倍性不同发育时期材料未开花花序各50份。取中上部小花用FAA固定液(50%乙醇89ml、冰乙酸6ml、37%甲醛5ml)固定,爱氏(Ehrlich’s)苏木精整体染色法染色(苏木精1g溶于95%乙醇25ml、冰醋酸5ml、甘油50ml、硫酸铝钾5g、蒸馏水50ml),常规石蜡切片法制片。1.2.2整体染色23d于孕穗期收集供试材料花序各100枚,卡诺固定液(无水乙醇∶冰乙酸体积比3∶1)固定2h后经过95%、80%、70%乙醇处理,转入苏木精染液中整体染色2~3d。染色后在解剖镜下剥离小花外稃,手术刀横切花药释放内容物,镊子取走多余杂质后盖上盖玻片,于Leica2000显微镜100倍视野下观察扁穗牛鞭草花粉母细胞减数分裂过程。1.2.3不同倍性材料对花粉萌发的影响采用棉蓝-乳酸-酚染色法(苯胺蓝1g溶于下列配比的乳酸苯酚混合液中:乳酸25ml、苯酚25ml、甘油25ml、蒸馏水25ml)对不同倍性材料自花、异花授粉后15min、30min、1h、2h、3h、4h、5h的花粉在柱头上的萌发生长情况进行观察(室温27℃条件下)。2结果与分析2.1小菌株的发生和雄配子的结构和发育2.1.1花粉母细胞减数分裂期k花粉涂片观察发现,六倍体扁穗牛鞭草‘广益’和四倍体H052花粉母细胞减数分裂过程一致。花粉母细胞减数分裂经细线期、偶线期进入粗线期(图1-A)。由于同源染色体的联会配对,二价体继续螺旋化变短加粗,逐渐可辨别染色体首尾。随后进入双线期,非姊妹染色体单体之间发生片段互换。进入终变期二价体高度浓缩,交叉端化,中间交叉数目减少,呈现出粗短的“棒状”形态,核仁变小并逐渐消失,二价体分散于核膜内缘,形态清晰可见(图1-B)。花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ染色体在细胞板上呈“一字型”排列,并相互重叠(图1-C)。后期Ⅰ联会的染色体彼此分开,在纺锤丝的牵引下向两极移动(图1-D)。后期Ⅰ染色体数目减半,形成二分体。第一次减数分裂完成后快速经过前期Ⅱ(图1-E)和中期Ⅱ,进入后期Ⅱ。二分体细胞的姊妹染色单体分离,每个染色体上的两个单体分开,移向细胞两极,此时可见细胞内四组染色体和两组纺锤丝(图1-F)。染色单体达到两极后开始解螺旋,当新的核膜、核仁形成时立即进入四分体时期。此时,染色体单体完成解螺旋,子细胞中央形成细胞板,新的核膜、核仁形成,最终形成四分体(图1-G)。扁穗牛鞭草花粉母细胞减数分裂完成后,形成十字形排列的左右对称型四分体。大量涂片观察发现,六倍体扁穗牛鞭草‘广益’和四倍体H052花粉母细胞减数分裂过程中均存在异常状况,主要表现在第二次减数分裂后期胞质分裂不同步(图1-H)。对异常现象统计分析后发现,六倍体材料异常率为22.58%,远大于四倍体材料的3.41%,说明四倍体材料H052花粉母细胞减数分裂过程基本正常,而六倍体‘广益’异常率较高。2.1.2小培养和生殖细胞四倍体H052和六倍体‘广益’雄配子发育过程基本一致。随着胼胝质溶解消失,小孢子被释放。当小孢子细胞质出现许多小液泡,逐渐汇合成大液泡时,小孢子体积显著增大。伴随着小孢子液泡出现,小孢子表现出一定极性,首先核从中央移到一侧,随后小孢子在药室内定向排列,即规则地沿着花药壁排列,细胞核均固定于花药腔一侧,远离绒毡层,与萌发孔相对,为单核靠边期(图2-A)。小孢子核减数分裂后形成含有1个营养核和1个生殖核的二核花粉粒。两核刚形成时靠近,随后营养核向萌发孔移动,且逐渐增大。二核细胞花粉内液泡逐渐消失,营养核积累营养物质,花粉壁加厚,形成一对精子(图2-B)。生殖细胞分裂未见细胞板产生,胞质分裂属于缢缩方式。精子形如橄榄,后变为月牙形。两枚精子在成熟花粉中没有固定的排列位置,有时还互成一定角度(图2-C)。2.1.3单子叶型分布特点孢原细胞第一次平周分裂向外产生的初生壁细胞发育为药室内壁,初生造孢细胞再经一次平周分裂形成次生壁细胞,次生壁细胞经一次平周分裂形成中层和绒毡层。次生造孢时,药壁分化完成,发育完全的药壁可分为表皮、药室内壁、中层和绒毡层(图2-D)。按Davis划分标准,扁穗牛鞭草花药壁发育类型为单子叶型。药壁发育随小孢子发生、雄配子体的发育而进行。表皮细胞在发育过程中进行垂周分裂以适应内部组织变化,逐渐拉长且具角质层。中层细胞在整个发育过程中逐渐解体。绒毡层细胞较外围药壁细胞大,细胞质浓,液泡少而小,具有腺细胞的特征。小孢子母细胞减数分裂后期,绒毡层细胞开始退化。小孢子单核靠边期,绒毡层细胞质几乎完全消失并开始出现纤维状加厚(图2-D)。纤维状加厚在花粉粒成熟时达到最高峰,药壁只有一层,表皮已破裂(图2-E)。大量切片观察发现,四倍体H052花药壁发育基本正常,而六倍体‘广益’小孢子发育过程中绒毡层解体较多,占所观察切片数的15%左右(图2-F,图2-G)。2.2花粉管生长速度四倍体材料花粉被柱头捕捉后立即萌发,15~30min后可观察到花粉管前端进入柱头表面的乳突细胞(图3-A)。随着花粉粒在柱头上停留时间增长,萌发花粉数逐渐增加。授粉后2h内,花粉管生长较快(图3-B),2h后花粉管生长速度减缓。四倍体材料花粉管生长正常,伸入胚囊释放精细胞。六倍体植株花粉在柱头上附着,萌发缓慢,花粉管不伸入柱头乳突细胞,盘绕在柱头表面(图3-C),即使伸入柱头也会中途萎缩死亡停止生长,无法伸入胚囊释放精细胞(图3-D)。3花粉母细胞减数分裂规律及与小合成关系Davis对禾本科植物胚胎发育基本特征做了全面总结,扁穗牛鞭草小孢子发生与雄配子体的发育与其描述基本相符:小孢子母细胞减数分裂过程的胞质分裂为连续型,四分体为左右对称型。成熟花粉为三细胞型,具单萌发孔;花药壁发育为单子叶型,腺质绒毡层。Wilms对不同倍性的牛鞭草(H.altissima)花粉粒发育情况进行了研究,表明所有倍性的牛鞭草均能产生数量较多的可见花粉粒。本研究通过常规石蜡切片法对四倍体扁穗牛鞭草H052、六倍体扁穗牛鞭划‘广益’小孢子发生和雄配子体发育过程进行对比,并对照水稻、羊草、小麦、星星草(Puccinelliatenuiflora)等禾本科植物胚胎学发育过程后判断,‘广益’与H052小孢子发生与雄配子体发育过程相似。Quesenberry对二倍体和四倍体牛鞭草材料花粉母细胞减数分裂规律进行了研究,发现二倍体牛鞭草花粉母细胞减数分裂过程比较规则,而四倍体牛鞭草存在极少的染色体落后现象。本研究并未在四倍体H052花粉母细胞减数分裂中观察到染色体落后现象,而在六倍体‘广益’花粉母细胞的第二次减数分裂进行到中后期时,观察到胞质分裂不同步现象,出现频率达22.58%。花药壁发育正常与否,直接关系到小孢子育性。大量研究表明,由于绒毡层的发育异常往往导致小孢子败育。根据现有文献,未见对牛鞭草属植物花药壁发育的详尽报道。本研究发现,两份材料具有相似的花药壁结构与发育过程,但‘广益’绒毡层细胞在小孢子母细胞减数分裂时期提前退化或崩解现象占观察切片15%左右。本研究虽未对绒毡层出现异常后小孢子的表现进行观察,但由于绒毡层在小孢子整个发育过程中有营养供给作用,如果绒毡层提前退化崩解,小孢子正常发育将受到严重影响。导致小孢子发育异常的原因很多。有研究认为,小孢子母细胞减数分裂异常影响了小孢子和绒毡层之间的协调性而导致不育。Zhang等认为,小孢子母细胞不能进行正常对称的减数分裂是由核仁异常定位造成的。谢潮添认为,小孢子败育是由于不育基因影响了小孢子母细胞减数分裂后的细胞周期调控,使小孢子提前进入下轮细胞周期。李扬汉等认为,小孢子发育异常或绒毡层发育异常是由于在发育期间受了温度、湿度、光照等环境条件的影响。康向阳也认为,环境条件可以导致绒毡层组织结构异常,从而使花粉败育。Suzuki等观察了高温下绒毡层细胞的超微结构,并发现高温可以影响绒毡层细胞的内质网膜结构,导致绒毡层的提前降解并使花粉败育。本研究中两份材料均种植在同一环境条件下,H052花粉母细胞减数分裂正常,而‘广益’异常情况较多,这说明环境条件不是导致‘广益’小孢子和绒毡层发育异常的关键因素。程杏安等认为,败育和异常的不同在于:败育是由于小孢子结构和功能异