塔玛亚历山大藻对鳃组织na

塔玛亚历山大藻对鳃组织na

0n-磺酰氨甲酰基类毒素中毒的爆发严重威胁了畜牧业。麻痹性苦毒（pm）是一个重要因素。在亚太地区，从1934年到1994年的赤潮对水产养殖的损害中，麻痹性苦毒事件占41.7%。这些事件主要是由p.bamaenevar.cov等甲藻引起的。大多数时间分布在塔马利亚海岸。麻痹性贝毒是一类四氢嘌呤的衍生物.现在已经发现的毒素有20多种,根据R4基团的不同可以分为4类,分别是氨基甲酸酯类毒素(Carbamatetoxin),包括石房蛤毒素(STX),新石房蛤毒素(neoSTX),膝沟藻毒素1-4(GTXI-4);N-磺酰氨甲酰基类毒素(N-sulfcarbamoy1toxins),包括B1-2,C1-4;脱氨甲酰基类毒素(decarbamoyltoxin),包括dcSTX,dcneoSTX,dcGTXI-4;脱氧脱氨甲酰基类毒素(deoxydecarbamoy1toxins),包括doSTX,doGTX2,3,最近又在一种蟹Zosimusaeneus中检出了石房蛤毒素和新石房蛤毒素的N-羟基衍生物(N-hydroxycarbamoylderivatives)hySTX和hyneoSTX,可能是一类新的麻痹性贝毒毒素.由于Na+,K+—ATP酶在低等、高等生物体内普遍存在,具有广泛的生态意义,在机体中起到至关重要的作用,并且是多种毒物攻击的靶点.因此在本次实验中采用检测染毒生物体兴奋性和分泌性组织中Na+,K+—ATP酶活力的方法,对塔玛亚历山大藻对该酶的影响及机理进行研究.传统的观点认为毒素对贝类本身没有影响,贝类只是起中间媒介的作用.但80年代以后的研究表明,有毒藻能够影响贝类,影响的大小与贝的种类以及以往是否接触过有毒藻有关.不同种的贝对有毒藻的反应差别很大.从已有的实验看,赤潮密度下有毒藻可以使贝产生下述反应:1)是闭壳反应,尤其是没有接触过有毒藻的贝中闭壳反应明显;2)滤水率下降,这在一定程度上与贝的闭壳反应有关,但也有贝表现出滤水率增加或不变的现象;3)摄食的选择性,大部分可以摄食有毒藻,但有的贝如沙海螂(Mya.arenaria)表现出摄食选择现象,有毒藻只出现在假粪中;4)影响足丝分泌;5)耗氧率和心脏活动受到影响.文献对塔玛亚历山大藻对扇贝受精、胚胎发育及幼体变态等影响进行了研究,发现该藻对受试生物存在明显的抑制效应.但有关塔玛亚历山大藻对动物组织中ATP酶的影响目前在国内尚未见报道.为进一步了解塔玛亚历山大藻的毒作用机制,笔者选用分布广,数量多,有一定经济价值的菲律宾蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、翡翠贻贝(PernaviridisLinnaeus),研究塔玛亚历山大藻体对这些动物组织Na+,K+—ATP酶的影响.1材料和方法1.1na+、k+—原理Na+,K+—ATP酶是一组在细胞内离子转运和能量代谢过程中起重要作用的酶系统.它从水解ATP分子中获得能量,逆电化学梯度转运Na+和K+,也称钠泵.Na+,K+—ATP酶广泛分布于各类细胞质膜上,其活性在不同的组织内差异很大,在兴奋性和分泌性组织中酶活性很高.麻痹性贝毒的毒理机制是在分子层级上,阻断钠离子内流,其对钠离子通道具有特殊亲和性.当毒素与钠离子通道结合后,将会使神经传导发生困难.使细胞不能提供正常活动所需要的能量,严重情况下,可导致生物死亡.Na+,K+—ATP酶将腺三磷(ATP)水解为腺二磷(ADP)和无机磷,在实验中以无机磷的释放量来表示酶的活性.1.2非规划性培养基塔玛亚历山大藻由本实验室培养,培养条件为非无菌培养,f/2培养基;温度(20±0.5)℃;光照3000lx;光暗比为12∶12.实验用藻取自指数生长期.1.3设备1)DU520型紫外分光光度计;2)2DPR-52D型高速冷冻离心机;3)玻璃匀浆器;4)电子天平;5)解剖工具.1.4实验方法1.4.1对不同浮液藻细胞的毒力将采回的菲律宾蛤仔在沙滤海水中暂养24h后,挑选大小均匀、足丝分泌正常的个体随机分配到3个实验组中,每组放入8只蛤仔(壳长为(3±0.56)cm)及1000mL沙滤海水.对照组水体仅为1000mL沙滤海水,实验组分别加入浓缩藻液,使其水中塔玛亚历山大藻细胞浓度分别为35000cell/mL和17500cell/mL.在不充气,不换水下染毒48h后,解剖取样.暂养后的翡翠贻贝被分在染毒组和对照组,每组放8只,对照组饲养在2000mL沙滤海水中,染毒组为2000mL沙滤海水加入浓缩藻液,使藻细胞密度为10000cell/mL,染毒48h后解剖取样.1.4.2活性成分检测由于菲律宾蛤仔个体组织较小,故取样时,将1组合为1个样进行测量,而贻贝则1贝为1个样品.解剖出来的鳃及内脏囊先称重,每克样品中加入4mL线粒体提取液,匀浆后以2750rad/min离心10min,以去除细胞碎片.上清液以11500rad/min的转速离心20min,得线粒体沉淀,将线粒体沉淀物溶于1mL线粒体悬浮液中,置于-80℃低温冰箱内以供测定Na+,K+—ATP酶活力使用.1.4.3样品中的蛋白质含量测定1.4.4na-，k-kp酶活性测定2结果2.1两组k+—菲律宾蛤仔的实验结果结果显示实验组比对照组的菲律宾蛤仔鳃及内脏囊Na+,K+—ATP酶的活性高,而17500cell/mL组酶活力又比35000cell/mL高.且组间差异显著(P<0.5).见图1.2.2两组血清na+、k+—翡翠贻贝实验结果由表1可见,染毒组翡翠贻贝鳃组织内的Na+,K+—ATP酶平均活力为10.032±2.231,较对照组的6.449±2.272要强,两组个体间鳃组织Na+,K+—ATP酶活力差异显著(P<0.5).3藻密度对金鱼肝胰腺组织na+,k+—讨论水中含有塔玛亚历山大藻使得菲律宾蛤仔鳃组织Na+,K+—ATP酶活性有所增高,但并不是随着藻密度的增大而增大,在实验中可以看出藻密度在17500cell/mL时酶活力达到较高水平(2.112),在35000cell/mL时有所下降(2.073).而水中该藻密度为10000cell/mL时同样明显提高翡翠贻贝鳃组织Na+,K+—ATP酶活性(比对照组增加0.6倍).这说明塔玛亚历山大藻活藻体可造成贝类鳃组织Na+,K+—ATP酶活性改变.而且,在较低的浓度下往往是增加酶活性,较高浓度下酶的活性反而下降.笔者认为这是因为PSP进入动物体与钠离子通道结合,阻断钠离子内流.而生物的应激反应促使酶超常活动以抵消危害,因此使得Na+,K+—ATP酶的活力增加.生物体在这种不良环境下的这种应激反应在不少研究中已被证实,如藻类在低浓度农药影响下会增加光合作用强度和分裂速度,但随着农药浓度的加大,二者均被抑制而降低.当然应激反应是有限的,如果外界影响超出机体的调节能力,则必然导致机体正常功能受损,因此,最终将表现出抑制效应.本实验也显示随着藻类密度的增加,塔玛亚历山大藻的毒性使得动物Na+,K+—ATP酶受到抑制,活性转而呈下降趋势.4排肝胰腺组织p酶活性的变化水中具有一定密度(