膝沟藻毒素对麻痹性贝毒毒性的早期预测指标

膝沟藻毒素对麻痹性贝毒毒性的早期预测指标

麻痹性病毒（cp）是目前已知的海洋藻类中最常见的中毒类型，对人类影响最大。中国东海和南海海域尤其是东海海域，报告了许多由有毒贝类引起的中毒事件。红色浪潮藻类的毒性筛选方法是先进的生物育种方法。经过20多年的发展，它形成了多种过滤技术，如化学法、免疫法、细胞内毒性法等。每个筛选方法都有各自的优缺点，但不能进行初步预测。无论对个体的影响多复杂，还是对最终的影响如何，初始作用都是从细胞的分子水平开始的，并逐渐反映在细胞、器官、个体、群落、群落和生态系统的各个层面。因此，从分子水平筛选赤潮毒素的毒性具有初步预测价值。我们使用低剂量和短期使用的膝沟藻类毒素gtx-1.4（psp的主要成分之一）来测量大鼠脑中乙酰胆碱（ach）、no的含量，以及乙酰胆碱酯酶（ache）和氧氮化酶（nos）的活力，探索急性暴露后信息的分子传输机制，为找到初评价psp毒性信息提供重要依据。1材料和方法1.1标准品和试剂实验动物,健康的ICR品系成年小鼠,体重25～30g,由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供;GTX-1,4标准品,购于加拿大海洋生物研究所;硫代ACh(ASCh,w=99%)、双硝基二硫代苯甲酸(DTNB,w=99%)、还原型谷胱甘肽(w=98%)、硫酸毒扁豆碱均购于德国Merck公司;NO和NOS试剂盒购于南京建成生物工程研究所.1.2两组暴露时间比较动物暴露,将动物分为6组,每组只数n=5.暴露组腹腔注射体重剂量为1μg/kgGTX-1,4,对照组注射等量溶剂,暴露时间分别为60,90,120min.1.3各指标的测定ACh含量测定采用碱性盐酸羟胺测定法,AChE活力测定采用改良Ellman法,NO含量和NOS活力的测定依据试剂盒要求进行.1.4统计分析采用SPSS11.0软件进行t检验和协方差分析.2结果2.1对小鼠脑中ach含量的影响由表1可见(其中:x¯x¯为平均值;SD为标准方差),GTX-1,4暴露60min时暴露组ACh含量显著升高(P<0.01),90min时显著下降(P<0.05),120min时没有明显变化(P>0.05).协方差分析的结果显示,90、120min小鼠脑中Ach含量与60min值均存在显著差异(P<0.01),与90min相比,120min值显著升高(P<0.05).随着时间的延长,小鼠脑中ACh含量呈先降低后升高的趋势,并且具有统计学显著性,至120min时暴露组与空白组没有显著变化.GTX-1,4暴露60min时小鼠脑中AChE活力变化空白组与暴露组没有明显差别(P>0.05),在90min活力明显下降(P<0.05),120min空白组与暴露组无显著差别(P>0.05).偏方差分析的结果显示,暴露90、120min小鼠脑中AChE含量与60min值的差异没有统计学显著性,120与90min也没有显著差异(P>0.05).2.2nos活力变化由表2可见,暴露60、90、120min时暴露组脑中NO含量均无显著变化(P>0.05).协方差分析的结果表明,90、120min均显著低于60min(P<0.01),90与120min之间没有明显的差别.说明暴露组脑中NO含量先升高,后下降,但没有持续性.暴露60、90min染毒组与空白组相比脑中NOS活力均没有显著差异(P>0.05),120min暴露组显著下降(P<0.01).协方差分析结果表明,90min时暴露组NOS活力明显低于60min(P<0.05),90与120min不存在显著差别(P>0.05).说明随着暴露时间的延长,暴露组NOS活力呈现降低趋势,至120min表现出与空白组显著的差别.3麻醉性贝毒对大鼠脑中c-fos基因表达的影响麻痹性贝毒属于神经毒素,能选择性、高亲和地结合Na+通道蛋白,阻断Na+内流,阻碍动作电位的形成.在正常情况下,大量Na+从细胞外液流入胞内,导致膜电位升高,即去极化.当膜电位去极化至一定程度引起Ca2+通道开放,使Ca2+内流,以及K+通道的开放使细胞重新复极化,麻痹性贝毒阻断了这一过程的发生.ACh作为细胞外的信号分子,储存于囊泡中,神经活动兴奋期,Ca2+进入细胞产生兴奋释放偶联,使囊泡与突出前膜结合,胞裂释放ACh,释放至突触间隙的ACh绝大部分被AChE水解.60min时暴露组ACh含量的显著升高可能是由于PSP的毒性作用抑制了其在激活状态下的释放,导致了短时间该物质的累积.PSP还影响了ACh的基础释放,毒性作用开始由于ACh激活状态下的释放被抑制其含量升高,但是随着时间的延长,ACh逐渐消耗,而相应的基础释放却被抑制,导致ACh含量下降.但是PSP的毒性作用在本实验中没有观察持续效应,在120min时暴露组脑中ACh含量已经与空白组无明显差别.ACh的水解酶AChE活力敏感性低于ACh,只在90min时观察到AChE活力低于空白组,差异具有统计学意义(P<0.05),但是这种降低并没有持续作用,在120min时酶活力又恢复正常值.GTX-1,4急性暴露实验结果说明,麻痹性贝毒影响了胆碱能神经递质的释放,表明GTX-1,4对神经信号传导系统中第一信使——胆碱能神经递质有毒性作用.乙酰胆碱与神经系统的学习记忆、感觉运动等功能都有密切的关系.刘洁生等的研究结果也表明,低水平长期摄入PSP毒素对大鼠学习记忆能力及肌肉运动耐力可造成一定程度的损害.实验结果表明,GTX-1,4可影响脑中NOS活力,但是对NO含量没有显著影响.随着染毒时间的增加,脑中NOS活力逐渐降低,120min明显低于空白组.说明GTX-1,4对脑中NOS活力的影响与暴露持续时间有关.以上现象可能与刺激因素增强引起的机能代偿有关,当机能的代偿能力达到极限后,再度引起降低.NOS活力的代偿性增高和失代偿性降低都是非正常状态.NOS是合成NO的关键酶,NOS活力的降低将会导致NO含量的减少,表现出两者的正相关性.实验结果表明,NOS活力与NO含量是正相关关系.通过以上分析认为,GTX-1,4对脑中NOS的影响更加显著,并表现出时间效应关系.NO递质在体内具有第二信使的作用,实验结果表明麻痹性贝毒影响了小鼠体内第二信使的正常生理功能.有研究表明,麻痹性贝毒急性暴露60min就观察到鱼脑中c-fos基因表达的显著降低,与麻痹性贝毒具有类似致毒机理的河豚毒素抑制了小鼠大脑皮层、视觉系统以及纹状体中c-fos基因表达.由此可见,麻痹性贝毒能够对动物体内神经信号传统的第三信使起抑制作用.Andrinolo等研究STX对成年猫的毒性作用,结果表明只有在浓度较高时STX才能透过血脑屏障进入大脑,实验中使用的标准毒素与STX具有相同的致毒机理,在低剂量短时间内可能尚未进入小鼠脑中,但是在短时间内已经出现了胆碱能递质的变化,这说明毒素的毒性作用可能通过信号传导机制作用到大脑.与赤潮藻毒素毒性检测其他方法比较,目前通用的小白鼠法能在较短时间(15min左右)内确定毒素的毒性,但是需要在较高浓度下暴露,敏感性比较差;液相色谱法分析贝类中藻毒素含量的分析过程复杂,需要专业的操作人员;酶联免疫技术具有快速、灵敏的优点,但是费用较高.本文主要依据PSP的半数致死浓度LD50,小鼠腹腔注射的半数致死量为10μg/kg,选定1/10的LD50(i.p.),即1μg/kg,作为暴露浓度,而暴露时间节点的选择主要依据摄入PSP后出现麻痹症状的时间以及PSP在哺乳动物体内的代谢规律.一般情况下PSP摄入0.5～2h开始出现症状,PSP在体内的生命半衰期为90min.所以在实验中选择症状出现的时间60、120min,以及生命半衰期90min作为暴露时间.本文通过观察神经递质及过氧化损伤指标的变化,在低剂量(1/10LD5