色氨酸代谢产物对肝癌细胞

色氨酸代谢产物对肝癌细胞的作用1整理课件立论依据

一研究意义〔1〕原发性肝细胞癌〔HCC〕是我国常见恶性肿瘤之一，在消化道肿瘤中，其发病率仅次于胃癌。目前肝癌的治疗，除手术治疗外，化疗、放疗、生物和免疫治疗等多种治疗措施的综合运用，为提高患者生存率起到了积极的作用。但是至今，并没有找到根治肝癌的有效方法。2整理课件(2)自Tayor等提出IFN-γ对肿瘤生长的抑制作用是其诱导色氨酸代谢所致的观点后，与色氨酸分解代谢有关的酶——吲哚胺2，3双加氧酶〔IDO〕和肿瘤的关系开始倍受关注。3整理课件

近期的研究发现，在不同类型的肿瘤中，IDO可以扮演完全不同的角色。

4整理课件

在急性髓细胞样白血病、黑色素瘤等肿瘤中，IDO可以通过抑制T细胞，从而促进肿瘤的生长；而在肝癌等肿瘤中，IDO的存在可以提高机体的抗癌细胞作用,目前这一作用的具体机制尚不十分清楚。5整理课件〔3〕IDO是色氨酸分解代谢的限速酶，对色氨酸沿犬尿酸途径进行分解起到了重要作用。

IDO在多种组织中有表达，在感染、肿瘤、器官移植、自身免疫性疾病以及妊娠期间，IDO的活性增强，加速色氨酸的分解。脂多糖〔LPS〕、IFN-γ等细胞因子能够诱导巨噬细胞、树突状细胞等表达IDO。

6整理课件IDO的分子式为：

NH2ONH2OHOIDO为偏脂溶性物质，可溶解于DMSO溶剂中。

7整理课件IDO催化反响如下：

色氨酸

IDON-甲酰尿氨酸

甲酰胺酶

L-犬尿素犬尿素3-羟化酶犬尿素酶3-羟基犬尿酸

邻氨基苯甲酸犬尿素酶

非特异性羟化

羟基氨基苯甲酸

氧化酶

喹啉酸8整理课件二国内外研究现状：

IshioT等在体外培养实验中发现，外周单核细胞参加肝癌细胞株HepG2或PLC/PRF/5共同培养后，可显著诱导单核细胞中IDOmRNA的表达。外周单核细胞抗肝癌细胞的细胞毒性作用正好与IDOmRNA的表达水平成正比，参加IDO的抑制剂1-甲基色氨酸〔1-MT〕后可以降低细胞毒性作用。IDO阳性的肝细胞癌病人在肝切除术后，无复发生存率高于IDO阴性的患者。

9整理课件二国内外研究现状：KaiS等证明IDO可以增强NK细胞杀伤K562细胞(慢性髓性白血病细胞系)和HepG2细胞的功能。给与1-MT可以降低老鼠NK细胞毒素的活性。

10整理课件二国内外研究现状：

GuidoFrumento等证明L-犬尿素、邻吡啶甲酸和喹啉酸等色氨酸代谢产物可以抑制某些淋巴细胞的增殖。此效应在色氨酸缺乏时更为明显。DariuszPawlak等发现喹啉酸在1000µM/L浓度水平上可以降低HepG2细胞的活性。11整理课件二国内外研究现状：

总之，IDO抗肝癌细胞的作用机制尚处于摸索阶段，还有许多值得研究的地方。本课题将主要研究色氨酸在IDO催化下分解生成的几种代谢产物对肝癌细胞的生长和凋亡有何影响。

12整理课件研究方案

一研究目的

观察色氨酸经IDO催化后分解生成的各种代谢产物的量及其代谢产物对肝癌细胞的生长及凋亡的影响，为临床治疗肝癌提供新思路。13整理课件二研究内容高效液相色谱法测定色氨酸代谢产物的量。肝癌细胞的培养。MTT法测定代谢产物对HepG2细胞的增值的抑制作用及色氨酸缺乏对这一作用的影响。流式细胞术观察代谢产物对肝癌细胞细胞周期的影响。

14整理课件三拟解决的关键问题

1HepG2细胞的培养

2从细胞水平来验证色氨酸的代谢产物对肝癌细胞是否有抑制增殖、周期阻滞、诱导凋亡的作用。

3各代谢产物浓度范围及作用时间的选定均为本试验的技术关键

4利用高效液相色谱法对色氨酸的代谢产物进行定量分析

15整理课件四技术路线(第一步〕。

HepG2细胞株

体外培养

细胞浓度到达104/ml

分0.1,1,10，100，1000µM/L浓度参加代谢产物

12h,24h,36h,48h后分别检测

MTT法

HepG2细胞抑制率

统计学分析

16整理课件四技术路线〔第二步〕。

HepG2细胞株

体外培养

细胞浓度到达104/ml

分0.5,5,50，500，5000µM/L浓度参加IDO

12h,24h,36h,48h后分别检测MTT法HPLC法

HepG2细胞抑制率各代谢产物的量

统计学分析.

17整理课件四技术路线〔第三步〕

HepG2细胞株

体外培养

细胞浓度到达104/ml

根据统计学分析结果加药，作用一定时间离心沉淀后收集细胞调整细胞浓度为5*106/ml流式细胞术细胞周期的变化分析结果18整理课件六

实验方案

1细胞培养：HepG2细胞株在DMEM培养液中传代培养。

2加药：将培养好的HepG2细胞进行胰酶消化，制成104/ml单细胞悬液，置于反响板内，同时加药

19整理课件(1)选定三种代谢产物〔L-犬尿素、3-羟基犬尿酸、喹啉酸〕进行试验。

色氨酸充足的条件下〔30µM/L〕,将每种代谢产物分〔0.1，1,10，100，1000µM/L〕5个浓度梯度，(12h,24h,36h,48h)4个反响时间，用MTT法测细胞抑制率。绘制时间关系曲线。

另设色氨酸空白组为对照组

20整理课件(2)色氨酸充足的条件下〔30µM/L〕参加IDO，分〔0.5，5,50，500，5000µM/L〕5个浓度梯度(12h,24h,36h,48h)4个反响时间，测细胞抑制率。并用高效液相色谱法〔HPLC〕测出三种代谢产物〔L-犬尿素、3-羟基犬尿酸、喹啉酸〕生成的量。

21整理课件3流式细胞术测定细胞周期：选取某个代谢产物最正确反响浓度和反响时间离心收集细胞，然后调整细胞为5×106/ml，处理后24h内上机分析。

22整理课件4统计学分析：统计描述：均数±标准差表示，析因设计的方差分析，样本之间比较用SNK-Q检验和t检验，P<0.05有统计学意义。数据分析采用SPSS11.0软件。23整理课件本课题的创新之处

首次将色氨酸在IDO的催化下分解生成的代谢产物单独作用于HepG2肝癌细胞株，探讨IDO抗肝癌细胞的作用机理，进一步研究其对肝癌的潜在治疗价值，并借此寻找肝癌治疗的新途径。24整理课件研究方案及预测进展

2007年3月底之前：在导师的指导下，查阅国内外文献资料，反复论证该课题的可行性、科学性、创新性；全面了解及掌握所需要的试剂等。2007年4月开始进行预实验，及时解决碰到的具体问题，并撰写综述。2007年6月后开始正式实验，做好实验纪录。2007年10月争取完成实验。2007年11月后整理实验纪录，做统计学处理，撰写科研论文。

25整理课件预期研究成果

预计试验结果为色氨酸代谢产物对HepG2细胞有抑制增殖,调节细胞周期的作用,该作用随药物浓度和时间的增加而增强。色氨酸代谢产物有诱导细胞凋亡的作用。色氨酸代谢产物在肝癌治疗上有潜在价值。26整理课件在充分的理论，成熟的实验条件，认真仔细的工作之后，相信能得到满意的结果。即使结果可能不尽人意，也会给以后的研究工作以珍贵的启示。27整理课件研究根底一学术条件：我院消化科有自己的实验室及科研经验丰富的博士生和硕士生导师进行指导。上几届研究生和导师王琦教授在肝癌有关方面作了大量的根底性研究工作，积累了丰富的理论知识和实践经验。28整理课件二实验条件

我院实验室和山西医科大学实验室具备专业的技术人员和所需的各种仪器设备，具有多年的细胞培养经验，色谱法、MTT法、流式细胞术均已成熟，可以确保实验顺利完成。

三所需经费已根本落实。29整理课件经费预算

支出科目

金额（万元）

计算根据及理由

1．合计

0．752．科研业务费0．05文献检索打印论文装订3．实验材料费0．40细胞培养试剂4．仪器设备费0．10实验室耗材光镜电镜5．协作费0．10液相色谱分析流式细胞术检测费用等6．研究组织实施费0．10论文交流30整理课件主要参考文献：

1.IshioT,GotoS,TaharaK,etal.Immunoactivativeroleofindoleamine2,3-dioxygenaseinhumanhepatocellularcarcinoma[J]JournalofGastroenterologyandHepatology2004Vol19,319-326

2.KaiS,GotoS,TaharaK,etal.Inhibitionofindoleamine2,3-dioxygenasesuppressesNKcellactivityandacceleratestumorgrowth[J].JournalofExperimentalTherapeuticsandOncology2003,3:336-345.

3.KaiS,GotoS,TaharaK,etal.indoleamine2,3-dioxygenaseisnecessaryforcytolyticactivityofnaturalkillercells[J].ScandinavianJournalofImmunology.2004,59:177-182

31整理课件4.GuidoFrumento,RitaRotondo,MichelaTonetti,etal.Tryptophan-derivedcatabolitesareresponsibleforinhibitionofTandnaturalkillercellproliferationinducedbyindoleamine2,3-dioxygenase.[J]J.Exp.Med,2002,196(4):459-468.

5.FallarinoF,GrohmanUn,VaccaC,etal.Tcellapoptosisbytryptophancatabolism[J].CellDeathandDifferentiation,2002,9,1069-1077.

6.DariuszPawlak,MariuszKoda,etal.Contributionofquinolinicacidinthedevelopmentofanemiaininsufficiency[J]AmJPhysiolRenalPhysiol2003,284:693-700

32整理课件7.TangXQ,ZhaoZG,WangHX,etal.Indoleamine2,3-dioxygenaseactivityinacutemyeloidleukemiacellscontributingt