纳米材料、金纳米颗粒、尺寸密度可控、功能化修饰、分子分离筛选

摘要生物离子通道因其具有高度的选择性与特异性，可以实现对不同的分子与离子的分离筛选，但其必须依靠磷脂双分子层，具有不稳定性，这就大大限制了它的应用。近年来,随着生物技术和纳米科学的不断进步，基于纳米材料构筑的功能分子分离筛选系统愈发成为相关领域的研究热点。人们利用纳米材料机械强度高、形貌和表面功能化多样性，以及与生物分子和其活动区域相似的尺度和维度等优点，设计和开发了具有多灵敏度和选择性的生物器件。本文工作主要包括以下两个方面：1.在阳极氧化铝（AAO）纳米孔道内可控的修饰单分散性的金纳米颗粒(AuNPs)。本实验利用聚多巴胺（PDA）的粘附性和还原性与氯金酸的氧化性，通过简单真空抽滤的方法在AAO纳米孔道内壁上修饰单分散的金纳米颗粒。同时，通过调节聚多巴胺溶液的浓度、氯金酸溶液的浓度等实验条件，成功地调节和控制了AAO孔道内表面附着的金纳米颗粒的尺寸（30-80nm）和分布密度（109-1012m-2）。2.对AAO孔道进行功能化修饰，构筑了基于AAO纳米孔道为基底的分子分离筛选体系。利用金原子与巯基结合形成Au-S键，本实验首先在修饰金颗粒的AAO孔道内选择性的修饰了疏水分子二十二烷基硫醇（C22H46S），在电化学驱动之后，检测亲水分子亚甲基蓝与疏水分子阿米替林跨膜运输浓度。结果显示经疏水分子功能化修饰的AAO孔道能够较好的分离筛选亲、疏水分子。其次在修饰金颗粒的AAO孔道内分别选择性的修饰L/D-半胱氨酸（L/D-Cys），在电化学驱动后，检测牛血清蛋白(BSA)分子分别通过L-Cys与D-Cys修饰的AAO孔道的跨膜运输浓度。结果显示经手性半胱氨酸修饰的AAO孔道对BSA有选择运输性。关键词：纳米材料、金纳米颗粒、尺寸密度可控、功能化修饰、分子分离筛选

AbstractBiologicalionchannelscanseparateandscreendifferentmoleculesandionsbecauseofitshighselectivityandspecificity,buttheymustrelyonphospholipidbilayers,whichisunstableandgreatlylimitsitsapplication.Inrecentyear,withthecontinuousdevelopmentofbiotechnologyandnanoscience,functionalmolecularseparationandscreeningsystemsbasedonnanomaterialconstructionhavebecomearesearchhotspotinrelatedfields.Biomaterialswithmultiplesensitivitiesandselectivitieshavebeendesignedanddevelopedusingtheadvantagesofhighmechanicalstrength,morphologicalandsurfacefunctionaldiversityofnanomaterials,andsimilarscalesanddimensionstobiomoleculesandtheiractiveregions.Thispapermainlyincludesthefollowingtwoaspects:Monodispersegoldnanoparticles(AuNPs)arecontrollablymodifiedinanodizedaluminum(AAO)nanochannels.Inthisexperiment,themonodispersegoldnanoparticlesweremodifiedontheinnerwalloftheAAOnanoporebysimplevacuumfiltrationusingtheadhesionandreducibilityofpolydopamine(PDA)andtheoxidizingpropertyofchloroauricacid.Atthesametime,byadjustingtheconcentrationofpolydopaminesolutionandtheconcentrationofchloroauricacidsolution,thesize(30-80nm)anddistributiondensity(109-1012m)ofgoldnanoparticlesattachedtotheinnersurfaceofAAOchannelweresuccessfullyadjustedandcontrolled.FunctionalmodificationofAAOporestoconstructamolecularseparationscreeningsystembasedonAAOnanopores.TheAu-Sbondwasformedbythecombinationofagoldatomandasulfhydrylgroup.Inthisexperiment,thehydrophobicmoleculebehenylthiolwasselectivelymodifiedintheAAOchannelofthemodifiedgoldparticle.Afterelectrochemicaldriving,thetransmembranetransportconcentrationofthehydrophilicmolecularmethyleneblueandthehydrophobicmoleculeamitriptylinewasmeasured.TheresultsshowthattheAAOporesfunctionalizedbyhydrophobicmoleculescanbeusedtoisolateandscreenpro-andhydrophobicmolecules.Secondly,L/D-cysteine(L/D-Cys)wasselectivelymodifiedintheAAOchannelofthemodifiedgoldparticles.Afterelectrochemicaldriving,Transmembranetransportconcentrationsofbovineserumalbumin(BSA)moleculesthroughL-CysandD-CysmodifiedAAOchannelsweremeasured.TheresultsshowthattheAAOchannelmodifiedbychiralcysteinehasaselectivetransportabilitytoBSA.Keyword:Nanomaterials；goldnanoparticle；controllablesizeanddensity；functionalmodification；molecularseparationandscreening目录第一章概述 51.1纳米孔的概述 51.1.1生物纳米孔 51.1.2固态纳米孔 61.2固态纳米孔/纳米通道的制备 61.2.1径迹刻蚀法 71.2.2模板法 71.2.3聚焦离子束（FIB）技术 71.3固态纳米孔/纳米通道生物功能化 81.4智能固态纳米孔/纳米通道的应用 91.4.1、能量转换 91.4.2分子与离子的分离筛选 111.5选题的意义及内容 121.5.1选题意义 121.5.2研究内容 12二、实验部分 132.1实验思路 132.2实验试剂及仪器 142.3实验步骤 152.3.1AAO孔道内修饰纳米金颗粒的实验具体步骤 152.3.2改变PDA及HAuCl4浓度，对AAO孔道金颗粒进行调控的实验步骤 162.3.3修饰金颗粒的AAO膜特异性修饰修饰疏水及其对亲、疏水分子的分离 162.3.4修饰金颗粒的AAO膜特异性修饰手性分子及其对牛血清蛋白的分离 18三、实验结果与讨论 193.1AAO膜孔道内修饰金纳米颗粒SEM形貌的表征 193.2、不同PDA浓度、HAuCl4浓度对孔道内金颗粒尺寸及密度的影响 203.2.1不同PDA浓度对金颗粒的尺寸及密度分布的影响 203.2.2、不同HAuCl4浓度对金颗粒的尺寸及密度分布的影响 213.2.3同时改变PDA、HAuCl4浓度对金颗粒的尺寸及密度分布的影响 223.3、AAO孔道内选择性修饰疏水分子的表征及其对亲、疏水分子筛选 233.3.1修饰二十二烷基硫醇的AAO膜的SEM孔道形貌表征 233.3.2修饰二十二烷基硫醇的AAO膜的接触角表征 243.3.3修饰二十二烷基硫醇的AAO膜对亲、疏水分子筛选 263.4AAO孔道内选择性的修饰手性分子及其对BSA分子选择性运输 28总结与展望 29致谢 30参考文献 31

第一章概述1.1纳米孔的概述孔径介于1-100nm，且大于孔的深度或处于同一数量级的孔状纳米结构称为纳米孔。反之，当孔深远大于孔径的结构称为纳米通道[1]。纳米孔根据其材料可以分为两大类：1、生物纳米孔；2、固态纳米孔；1.1.1生物纳米孔生物纳米孔是生物分子中形成的天然纳米孔道，如生物膜离子通道、溶血素（α-hemolysin，目前应用最为广泛的生物孔道材料，如图1所示）跨磷脂双层细胞膜形成的离子通道等，是生物体中控制信号分子[2]、遗传物质以及细胞或细胞器内外环境之间能量的运输[3]的重要结构。它们被称为膜蛋白嵌入细胞膜内，通过各种功能参与生物体的许多的生命过程[4]。作为极其敏感的机电元件，它们主要通过跨膜离子运输的方式来维持生物体的正常生理条件。例如，当大脑处于静止状态时，存在于神经细胞中的配体门控离子通道被关闭，而当特定神经递质与通道上的分子识别位点结合时，它们可被打开以允许特定离子通过。此外，感觉系统中存在的蛋白质通道可以直接响应特殊分子或物理刺激。例如，香草素受体可以对外界的刺激进行响应。这些蛋白质纳米孔也可以在体外实现许多重要的功能。经过几十年的发展，生物纳米孔已被广泛研究并应用。例如，OxfordNanoporeTechnologies已经用于一种商业便携式设备，通过蛋白质纳米孔进行分子分析。该装置适用于分析DNA、RNA、蛋白质和小分子，操作简单方便，分析效果好。这些蛋白质纳米孔已得到很好的发展和总结[5-7]。然而，生物离子通道必须依赖脆弱的磷脂双层，具有不稳定性，这不可避免地限制了它们在现实世界中大规模的应用。图1：α-溶血素生物蛋白孔1.1.2固态纳米孔固态纳米孔是在薄膜上人为制造的纳米级孔隙，常用仿生固态纳米孔道根据材料划分主要分为有机孔道、无机孔道以及复合孔道[8-9]。如图2所示。目前，有机孔道材料应用最广泛的主要是聚对苯二甲酸乙二醇酯（Polyethyleneterephthalate,PET）。采用重离子径迹刻蚀技术，可以实现不同结构、尺寸的PET纳米孔道的制备[10-12]。无机孔道材料主要包括阳极氧化铝膜（AAO）、氮化硅、玻璃等材料[13-15]。复合孔道材料是指通过物理化学技术，将不同孔道材料结合在一起形成的一种纳米孔道材料。另外，根据基底膜上纳米孔的数量划分，分为单纳米孔材料（膜上只有一个孔道）和多纳米孔材料（膜上有两个或两个以上的纳米孔道）两种[11]。与生物纳米孔相比，固态纳米孔具有孔径可调，机械强度高，力学、化学性能稳定等优势，并且可通过多种制备工艺制得，可以实现纳米孔的大规模制备与加工。通过改变纳米孔大小[16]、表面电荷[17]和极性[18]可改变固态纳米孔的表面与孔道的性质，使其具有特异性，可以选择性地分离筛选与运输物质。另外，通过调节纳米孔的孔径，可以对较大的分子和器件进行检测，例如DNA、DNA-蛋白质复合物等，成为新的纳米材料的表征手段。图2：仿生孔道分类1.2固态纳米孔/纳米通道的制备三种常见的固态孔结构分别是纳米孔、纳米通道以及纳米管，我们使用纳米孔/纳米通道来代表所有这些类型的固态孔结构。近年来，由于结构和功能与生物离子通道的相似性，固态纳米孔和纳米通道都引起了广泛的关注，与生物纳米孔相比，固态纳米孔/纳米通道具有孔径可调，机械强度高，力学、化学性能稳定等优势。所以，科学家致力于设计和构建与生物离子通道具有共同特征的固态纳米孔/纳米通道。固态纳米孔的常用制备方法包括：1.2.1径迹刻蚀法径迹刻蚀法包括两个步骤，首先是形成潜径迹区。高能离子穿过固体有机薄膜，将自己的能量传递给固体膜中的低能电子，并释放出二次电子流，二次电子迅速沿着固体膜的径迹向外扩散，使能量逐渐转变成原子的运动，实现固体膜的加热。释放出的热量使固体膜形成一个密度小、化学活性大的特殊区域，这个区域称为潜径迹区（图1.12）。其次是化学刻蚀。在刻蚀前，用365nm/254nm的紫外光辐照具有潜在径迹的有机薄膜，正反面各紫外辐照1h，使潜径迹区域化学活性增大，更容易蚀刻。然后，将紫外辐照后的膜与刻蚀液反应，由于经过高能离子辐射的区域化学活性大，刻蚀速度远远大于其他位置，在一定的条件限制下，该区域被刻蚀液溶解，其他区域未被溶解，从而形成特定形状的孔道。径迹刻蚀法常用于有机固态孔道的制备，例如苯二甲酸乙二醇酯(PET)，聚碳酸酯(PC)，聚酰亚胺(PI)等。目前人们利用并控制不同的刻蚀条件，已经得到了各种形状结构的有机纳米孔道[19]。1.2.2模板法在特定的模板膜上沉积所需要的孔道材料，然后去掉模板，制备所需材料的固体孔的方法称为模板法。一般模板法所用到的模板主要有：径迹刻蚀法制备的有机固态多孔膜[20]，分子筛[22]，阳极氧化铝（AAO）多孔膜[21]等。以AAO多孔膜为例，首先将AAO多孔膜为模板，在模板上沉积待成孔的物质，成型后，再将表面的沉积物按需要进行处理，最后应用化学腐蚀手段去除模板孔道，就可以得到所需材料的纳米通道。1.2.3聚焦离子束（FIB）技术聚焦离子束技术近20年来发展起来的新型刻蚀技术，是用于光刻掩模版修补和集成电路修饰而专门设计的一种精细加工技术。利用FIB技术制备纳米孔的基本原理是：利用离子束与晶体表面的作用，在离子束聚焦位置刻蚀掉晶体原子或分子，形成纳米孔洞。当一束具有几千电子伏特的离子束轰击材料表面时，将产生两种截然不同的效应。一种是原子尺寸的冲蚀过程，即瓣射。离子束将材料表面最外层的原子和分子刻蚀掉，形成一个小洞／小孔，通过该途径产生的纳米孔技术称作溅射刻蚀。另一种效应是离子束刺激材料表面原子或分子的横向迁移，沿表面移动的原子或分子进入已形成的小孔内，缩小甚至封闭住小孔。在表面原子或分子横向迁移的过程中，当达到预设纳米孔尺寸时，通过反馈机理的提示终止此过程。因而，轰击材料在这两种效应的作用下，产生一定尺寸的纳米孔。除了用于硅基材料的刻蚀外，这种技术还可用于刻蚀Al、Cr、W及聚合物材料，如聚甲基丙稀酸甲酯（PMMA）和聚酷亚胺（PI）等[21]。1.3固态纳米孔/纳米通道生物功能化到目前为止，有许多工作已经说明了固态离子纳米通道/纳米孔的最新发展，包括多样的制备方法[23]，功能化[24]，和具体的应用[25]。但很少关注生物分子功能化。近几年，生物分子及其类似物功能化修饰的固态离子纳米通道/纳米孔快速发展。生物分子具有许多优点：（1）核酸碱基互补配对，生物分子适体/靶标，抗原/抗体，酶/反应物，生物素/抗生物素蛋白和β-环糊精/氨基酸的特异性识别[26]；（2）对外界刺激的特异性反应[27]（如构象或电荷状态随pH值、金属/重金属离子、光和氧含量等变化而变化）；（3）结构扩增[28]；（4）高效酶促反应[29]。同时，固态纳米通道/纳米孔系统是有利的平台。第一，它们可以改变离子电流作为监测生物反应例如：特殊识别，外部刺激反应等的信号[30]。其次，纳米通道/纳米孔为纳米尺度的功能分子和分析物之间的相互作用提供了一个限制的区域[31]，这导致在纳米通道/纳米孔中产生了反应物容易和频繁传输的动力学效应，提高了反应常数。当固态纳米通道/纳米孔被生物分子功能化后，在实际应用中有两个主要特征[32]：特异性和信号放大，这是由于生物分子的优势和固态离子纳米通道/纳米孔的特性的结合，这两个特征与高度特异性和敏感性传感[33]，仿生运输[34]，和能量转换的应用有关。当纳米通道/纳米孔用生物分子功能化时，对于实现以上提到的功能的相关技术是十分重要的。这些技术涉及界面化学的许多基本机制，基本包括三种方式：（1）直接键合。根据生物分子官能团的不同，所选纳米通道/纳米孔材料（如聚合物，阳极氧化铝和玻璃）性质的差异，以及修饰功能分子方法的不同，采用传统的两步/三步法或改进版本。（2）间接键合。纳米通道/纳米孔的原始表面被新物质（例如Au）覆盖，然后在新产生的界面上进行功能化修饰。（3）非键合。通过静电作用将生物分子引入纳米通道/纳米孔或者甚至直接注入孔道内。本论文中使用的是阳极氧化铝（AAO）无机膜，在AAO内壁修饰金纳米颗粒，主要采用的第二种方式。间接键合首先是覆盖纳米通道/纳米孔的原始官能团，并且随后在新产生的表面上进行生物分子的功能化。常见的间接键合是将Au固定在纳米孔/纳米通道的外表面或内壁，由于Au与巯基（-SH）可形成Au-S键[35]，因此，可以将含有巯基的生物分子固定在纳米通道/纳米孔外表面或内壁上。通常，通过溅射或电化学方法沉积Au层。此外，利用聚多巴胺修饰纳米孔/纳米通道的外表面或内壁是另一种常见的间接键合方式。通过真空抽滤或浸泡等方式，将聚多巴胺（PDA）覆盖在纳米通道/纳米孔的原始化学表面上，由于聚多巴胺具有强的粘附性且存在许多官能团，例如儿茶酚，亚胺和胺等，其对于修饰特定的生物分子是十分重要的。PDA层还可以通过原位还原HAuCl4诱导Au纳米颗粒的形成，使纳米孔金属化，进而利用Au-S键使Au粒子表面官能化。1.4智能固态纳米孔/纳米通道的应用当溶液中的生物分子通过纳米孔/纳米通道，或生物分子固定于纳米孔/纳米通道时，在一定浓度的电解质溶液中，会有两种效应产生：静电效应[37]和空间位阻效应[38]。静电效应是对于荷电生物分子而言，当荷电生物分子通过特异性识别或共价键合于纳米孔壁时，会引起表面电荷密度或电荷性质的改变。此时，纳米孔壁与传输离子之间的相互作用也会发生相应的变化从而改变纳米孔中离子传输速率。空间位阻效应是对尺寸比较大的分子而言，当足够大的生物分子引入纳米孔／纳米通道后，会阻塞纳米孔／纳米通道，从而导致离子自由输运空间和输运量的减小。当采用一定的检测手段时，所检测到的离子传输量的变化可以间接对纳米空腔内固定的生物分子进行定性和定量分析。因此，纳米孔中的很多传感应用都是基于这两种效应发展起来的[39]。综上所述，纳米孔／通道材料的应用研究主要包括以下几个方面：1.4.1、能量转换能源的开发与利用是人类社会发展的基础。当今世界，不可再生能源的储量急剧下降，能源危机是当今世界面临的一大难题。为了解决这个问题，我们必须开发利用可再生能源及寻找能源转换的新方法。近年来，受生物离子通道的启发，仿生固态纳米孔/通道技术得到迅猛的发展，也为能量转换器件的小型化提供了基础[40,41]。基于纳米孔道的能源转换方法是利用纳米孔道在纳米尺度上特有的物理化学性质，将环境中存在的清洁能源转换为电能。与传统的发电与能量转换设备相比，它不需要机械转动装置，减少了驱动转动装置的能量消耗，同时也为电源部件的小型化和集成化提供了新思路。基于纳米孔道的能量的转换体系分为三类：1）基于纳米孔道的机械能-电能转换将孔道表面带有净余电荷的纳米孔置于电解质溶液时，会在溶液层中形成静电场,使溶液中的反离子聚集在表面附近形成一个离子分布。在有限区域内,例如微纳孔道内,这样的两层不同带电的区域形成表面双电荷层，通过外部机械压力将电解质溶液推过纳米孔道，使得电解质溶液在通过孔道内表面附近双电荷层时发生电荷分离，从而产生动电流和动电势。基于这种孔道双电荷层的机电转换思路最早在20世纪60年代被提出[42]。与传统的发电机相比，纳米流体发电装置的设备简单，只需要纳米孔道，电解质溶液，以及一定的压力差三个条件就能够实现机-电能量间的转换，减小了驱动机械设备的能量消耗，提高了能量转化效率。因此近年来，关于纳米流体电池的研究日益热门。2）基于仿生智能纳米孔道的盐差能转换盐差能是混合不同的盐溶液来释放能量，属于吉布斯自由能的一种，是清洁可再生能源，对环境友好。理论上均匀混合1m3的具有不同盐浓度的海水和河水,将产生1.7MJ的能量[46]。传统的方法是通过具有选择透过性的离子交换膜进行海水和淡水的混合,被称为反向电渗析技术，这是由Pattle[43]独立提出,当时他所得到的功率密度只有0.005mW/cm2，Weinstein和Leitz[44]使用一组交替排列阴离子和阳离子交换膜作为溶液混合膜组,所得到的功率密度仍然仅有0.017mW/cm2，所以此方法得到的功率密度低，难以满足实际需要，而且离子交换膜的成本昂贵，寿命短，限制了这种技术的发展。受到生物离子通道可以高效率地产生和积累来自环境中的能源,实现能量的转换、存储与利用的启发，科学家开始用具有规则形状及电荷选择性的固态纳米孔代替了离子交换膜，用反向电渗析的方法将盐差能转换为电能称为纳流体反向电渗析[45]。郭维等[46]在实验上得到的单纳米孔道的能量输出功率达到26pW,当孔密度达到108~1010/cm2时，功率密度可以达到3~260mW/cm2,比现有使用离子交换膜材料的反向电渗析体系高出了2~4个数量级。之所以能够很大程度上提高反渗透体系的工作效率，主要原因在于直通的纳米孔道大大降低了通道对电解质流体的流阻,从而提高了单位时间通过孔道的离子通量,提高了功率密度。固态纳米通道制备简单，价格低廉，为高效的利用盐差能提供了可能性。3）基于仿生智能纳米孔道的能源转换体系细菌视紫红质，是一种色素蛋白，它具有利用和转换光能的能力。在太阳光驱动下，它能够通过一系列的跨膜质子泵和质子通道将光能转换成为光电流。在这个过程中，离子通道具有十分重要的作用。受此启发，郭维等[45]将光酸分子引入到含有仿生质子通道的特殊设计的光电化学池中,通过对纳米通道构型和表面电荷的调控，成功的将光能转化为了电能。但目前转换效率太低，还需要进一步研究。ATP-酶（又称三磷酸腺苷酶）广泛存在于体内，它能够将ATP水解为ADP与磷酸根离子并释放能量，为生物的生命活动提供能量。受此启发，科学家模仿植物光合作用，通过将ATP-酶在聚合物多孔膜一侧上的组装，使得膜两端的质子浓度不同造成质子的流动，将光能转换为化学能[47]。1.4.2分子与离子的分离筛选纳米通道对分子和离子的分离筛选是由分子与离子的特性以及纳米通道内表面的性质决定的。根据分子与离子的尺寸大小、亲疏水性能、带电荷情况、特异性等特性的不同，可通过调整纳米通道的孔径、修饰亲疏水分子、修饰带电分子，特异性识别分子等方法实现不同分子通过纳米孔的难易程度不同，从而达到目标分子、离子分离的目的。Martin小组采用0.6nm金纳米管膜对大分子钌联吡啶Ru(bpy)32+及小分子甲基紫精MV2+在纳米管内的迁移行为进行研究，发现小分子MV2+很快的通过了纳米管膜，而大分子两周都无法通过金纳米管膜，从而实现了基于分子尺寸大小的完全分离[48]。Jirage等[49]将孔径小于1nm的纳米通道膜置于U型池中间，把分子量为79的吡啶和分子量为24的喹啉放在渗透池中，通过吸光度变化观察接收池中两种分子数量的变化。结果表明，只有体积较小的吡啶分子透过纳米通道膜进入接收池中，而体积较大的喹啉分子却没有透过纳米通道膜，从而实现将大小分子分离。Lee等通过调控阴离子表面活性剂在金纳米管壁的吸附，从而调控纳米管壁的亲疏水性质，建立了基于电位调控不同亲疏水性质的离子选择性传输的方法[50],Lee等通过硫醇化学将两性分子L-半胱氨酸固定于金纳米管的内壁，通过调控pH来改变纳米管中L-半胱氨酸的荷电性质，从而实现pH调控纳米管内不同荷电离子的选择性传输[51]。Martin等[52]将乙醇脱氢酶固定在聚碳酸酯膜纳米通道内，这种酶对苯丙氨酸具有识别能力，可以将D型和L型苯丙氨酸分离开来。并且证明纳米通道的内径越小，分离系数越高，当纳米通道为30nm时，分离系数高达4.9。1.5选题的意义及内容1.5.1选题意义生物纳米通道广泛存在于生物体的膜结构中，对于生物体的物质传输、能量传输、信号传递等生命活动起着至关重要的作用,并且生物纳米孔道具有特异性与选择性等优点，可以应用于分子分离筛选等方面，然而它必须依赖于磷脂双分子层才能发挥作用，稳定性差，而且它的孔径固定。因此限制了它在外在环境中的应用。近十几年来，受生物纳米通道的的启发，固态纳米孔/纳米通道技术逐渐发展起来。相比于生物纳米通道，其具有孔径可调、结构坚固稳定、物理性能稳定等优点。而且固态纳米孔/纳米通道可通过功能化修饰很大程度上模仿生物纳米通道，为研究生物纳米通道提供了新的思路。目前，仿生固态纳米孔/通道能够较好的分离筛选分子量差别大、带电荷情况不同的分子与离子，但对于分子量接近，带电荷情况相似的分子与离子的分离筛选效果不理想，在此背景下，本实验通过对AAO进行功能化修饰，建立一个以AAO为模板的分子分离筛选体系。旨在通过在孔道内修饰不同的功能分子对分子量接近、带电荷情况相似的，但亲、疏水性能不同或手性分子进行分离筛选1.5.2研究内容本论文主要通过对纳米孔的分类，固态纳米孔/纳米通道的制备方法、生物功能化及应用几个方面对纳米孔进行了综述，并探究了无机纳米孔AAO通过功能化修饰对分子分离筛选的作用。实验的主要内容包括以下三个方面：1.选取阳极氧化铝模板（AAO,孔径80-100nm）作为基底，利用聚多巴胺（PDA）溶液的粘附性与强还原性（将氯金酸（HAuCl4）中Au3+还原为Au），在AAO孔道的内壁上修饰金纳米颗粒。2.通过改变PDA浓度、HAuCl4浓度及两者同时改变对AAO孔道内金纳米颗粒的分布密度、尺寸大小进行有效的调控，旨在AAO膜孔道内修饰密度高、粒径大的金纳米颗粒。3.Au可与巯基形成稳定的Au-S键，在修饰有金颗粒的AAO孔道内选择性的修饰带巯基的功能分子，通过修饰疏水分子二十二烷基硫醇，探究其对电荷相同、尺寸类似的亲、疏水分子的筛选；通过修饰手性分子（L-半胱氨酸与D-半胱氨酸）探究其对牛血清蛋白(BSA)的选择性运输。二、实验部分2.1实验思路利用聚多巴胺（PDA）溶液具有强粘附性与强还原性，通过简单的真空抽滤的方法，将PDA抽滤通过阳极氧化铝（AAO）的孔道，使其在AAO内壁上形成一层薄膜。然后将此AAO膜浸泡在氯金酸（HAuCl4）溶液中，由于HAuCl4中的Au3+具有强氧化性，PDA可以将其还原为Au原子，并粘附在AAO膜的内壁，大量的金原子聚集在一起就形成了纳米金颗粒（如图2.1）。这样就可以在AAO膜的孔道内修饰上分散性的金纳米颗粒。我们通过改变PDA浓度与HAuCl4浓度等条件，实现了对孔道内的金纳米颗粒尺寸大小、分布密度的调控。而且金颗粒的表面与AAO内壁的表面性质差别很大，AAO膜内壁修饰金纳米颗粒后，就产生了性质迥异的两个界面,进一步还原了生物通道不同区域实现不同功能的复杂结构，为修饰不同的生物分子提供了可能。为探究AAO膜纳米孔在分子分离筛选的应用，本实验利用金原子与巯基反应形成稳定的Au-S键的原理，一方面，在修饰完纳米金颗粒的AAO膜中选择性的修饰上带巯基的疏水分子，在电化学的驱动下，检测其对疏水分子及亲水分子的通过情况。另一方面，在修饰完纳米金颗粒的AAO膜中选择性的修饰上带巯基的手性分子，在电化学驱动下，检测其对牛血清蛋白（BSA）的通过情况。图2.1AAO孔道内金颗粒的生长机理图2.2 实验试剂及仪器本实验所用到的相关实验药品如下表1所示，实验仪器如表2所示表2.1实验所用的相关试剂信息名称纯度/规格生产厂家亚甲基蓝，三水98%国药集团二十二烷基硫醇>98%东京化成工业株式会社阿米替林盐酸盐98%萨恩化学有限公司氯化钾>99.8%国药集团阳极氧化铝模板孔径80-100nm合肥普元纳米科技有限公司37%浓盐酸AR国药集团氯金酸99%SigmaAldrich多巴胺盐酸盐99%AlfaAesar十二水合磷酸一氢钠AR国药集团二水合磷酸氢二钠AR国药集团牛血清蛋白2mg/mL生工生物工程股份有两公司L/D-半胱氨酸98%北京百灵威科技有限公司表2.2实验所用到的相关实验仪器信息仪器名称仪器型号生产厂家超声波清洁机SB.120DT宁波新芝生物科技股份有限公司分析天平AL204电子天平梅特勒-托利多仪(上海)有限公司扫描电子显微镜SU8010株式会社日立制作所电化学工作站CHI660E上海振华科技有限公司循环水式真空泵SHZ-D(Ⅲ)武汉科尔仪器设备有限公司移液枪GE29721GILSON电热鼓风干燥箱DHG-9030A上海一恒科学仪器有限公司水浴锅HH-1数显恒温水槽荣华仪器制造有限公司超纯水仪NWUltra-pureWaterSystemHealForce接触角测试仪DSA-100KRUSS荧光光谱仪FS5英国爱丁堡仪器公司2.3实验步骤2.3.1AAO孔道内修饰纳米金颗粒的实验具体步骤：（1）V37%HCl:VH2O=1:2的盐酸溶液的配制：用胶头滴管取质量分数为37%的浓盐酸1.5mL于5mL试管中，用移液枪移取3mL去离子水混合均匀待用；（2）AAO膜的预处理：将AAO膜浸泡在（1）中的盐酸溶液中，每片约0.5mL。然后超声处理2min,用去离子水冲洗AAO膜表面；（3）1mMHAuCl4溶液的配制与预热：用200μL移液枪移取80μL50mMHAuCl4于试管中，加入3.92mL去离子水，混合均匀。用锡箔纸包好，置于35℃水浴锅中预热30min；（4）2mg/mL的PDA溶液的配制：用分析天平准确称取60mg多巴胺固体，加入12mL去离子水震荡混合均匀；（5）真空抽滤装置的搭建：将一张滤膜放在抽滤漏斗上，用水将滤纸浸润，通过用镊子移动滤纸的位置除去滤纸与漏斗间的气泡；（6）AAO膜的抽洗及多巴胺溶液的抽滤：将AAO膜置于滤膜上，加水浸没膜表面，打开真空泵开关，用镊子轻轻触碰膜边缘，检查膜是否吸紧。用移液枪滴加约50μL的去离子水于膜表面，反复抽洗5次。然后将（4）中的多巴胺溶液加在膜上，每片膜加1.5mL（大约滴加30次）；（7）PDA与HAuCl4的氧化还原反应：将抽滤完多巴胺溶液的AAO膜置于2mL离心管，加入（3）中的氯金酸溶液（每片0.5mL）。然后用锡纸包好，超声5min，置于35℃的水浴锅中反应2h；（8）修饰后AAO膜的洗涤与烘干：取出反应完的AAO膜（颜色为暗红色），用去离子水冲洗表面，然后在用去离子水抽洗10次以除去表面和孔道内残留的溶液。将抽洗之后的AAO膜置于120℃烘箱内恒温1.5h烘干；（9）利用扫描电镜对AAO膜孔道内金颗粒尺寸及密度进行表征：将制好的AAO膜切开以露出截面，用导电胶将切开的AAO垂直粘在样品台上，喷碳，然后送入样品室中，调节粗调、细调旋钮聚焦，找到并放大样品，观察金纳米颗粒的生长情况，从而对孔道内金颗粒的尺寸及大小进行分析；2.3.2改变PDA及HAuCl4浓度，对AAO孔道金颗粒进行调控的实验步骤（1）一系列浓度的PDA溶液的配制：分别称取0.8mg、8mg、20mg、80mg的多巴胺盐酸盐固体，加入4mL去离子水溶解，配制成0.2mg/mL、2mg/mL、5mg/mL、20mg/mL四种浓度的多巴胺溶液；（2）一系列浓度的HAuCl4溶液的配制：分别取8μL、80μL、160μL、800μL的50mMHAuCl4原溶液，加入去离子水稀释至4mL,配置成0.1mM、1mM、2mM、10mM四种浓度的HAuCl4溶液；（3）孔道内金纳米颗粒尺寸及密度的调控：通过改变1中（3）（4）步骤中的PDA及HAuCl4的浓度（本实验调节多巴胺浓度与氯金酸为：2mg/mL+0.1mM、2mg/mL+1mM、2mg/mL+10mM、0.2mg/mL+1mM、20mg/mL+1mM、5mg/mL+2mm六组），其他实验步骤不变，重复1过程，从而探究PDA浓度与HAuCl4浓度对金颗粒生长的影响，找出金颗粒生长尺寸大，密度大的最佳浓度。2.3.3修饰金颗粒的AAO膜特异性修饰修饰疏水及其对亲、疏水分子的分离（1）阿米替林盐酸盐（疏水分子）浓度曲线的滴定：分别配制10-2、10-3、8·10-4、5·10-4、4·10-4、2·10-4、10-4、5·10-5、2·10-5、10-5、5·10-6、10-6mol/L一系列浓度的阿米替林溶液（溶剂为0.1mol/L氯化钾溶液），通过紫外分光光度计测出每个浓度吸收值，用origin做出浓度-吸收值曲线；（2）亚甲基蓝（亲水分子）浓度曲线的滴定：分别配制10-2、10-4、5·10-5、10-5、5·10-6、10-6mol/L一系列浓度的亚甲基蓝溶液（溶剂为0.1mol/L氯化钾溶液），通过紫外分光光度计测出每个浓度吸收值，用origin做出其浓度-吸收值曲线；（3）1mM的二十二烷基硫醇（C22H46S，疏水分子）溶液的配制：称取3.42mg的C22H46S固体，加入10mL无水乙醇，用封口膜封住管口，超声15min至完全溶解；（4）AAO孔道内特异性修饰二十二烷基硫醇分子：将修饰有金纳米颗粒的AAO膜浸没于（3）中配好的溶液（每片约0.5mL）,用锡箔纸包好，反应过夜；第二天取出，用去离子水冲洗几次，除去表面的残留溶液；（5）修饰二十二烷基硫醇分子的AAO膜的接触角表征：取（4）制备的修饰二十二烷基硫醇分子的AAO膜置于洁净的玻璃片上，用移液枪滴加一滴去离子水（6μL）于膜上，固定玻璃片于KRUSSDSA-100接触角测量仪样品台上，测定接触角，取0s、30s、60s、120s、300s与600s为时间点，记录接触角随时间变化的规律。取AAO空白膜、修饰金颗粒的AAO膜做对比实验。（6）修饰二十二烷基硫醇分子的AAO膜的SEM表征：将（5）中的膜切开以露出截面，用导电胶将切开的膜垂直粘在样品台上，喷碳，送入样品室中，调节粗调、细调旋钮聚焦，找到并放大样品，观察孔道内的结构特征。并取AAO空白膜、修饰金颗粒的AAO膜做对比实验。（7）亲、疏水分子的跨膜电化学驱动：亲、疏水分子的跨膜电化学驱动的装置如下图2.1所示，其中电解液为0.1mol/L氯化钾溶液，右侧驱动原液为10-2mol/L阿米替林溶液或亚甲基蓝溶液，驱动时所用的膜为修饰有二十二烷基硫醇的AAO膜，电极为铂电极，驱动电压为+2V，驱动时间40min，驱动完成后取出左侧驱动液保存。将亲、疏水分子通过AAO空白膜、修饰有金颗粒的AAO膜的跨膜电化学驱动作为对比实验；（8）驱动液浓度的确定：将亲、疏水分子通过修饰有二十二烷基硫醇的AAO膜、空白AAO膜、修饰有金颗粒的AAO膜所得到的三种驱动液进行紫外吸收值测定，根据（1）（2）所得到的浓度曲线，将驱动液的紫外吸收值带入，算出每个驱动液的浓度；2.3.4修饰金颗粒的AAO膜特异性修饰手性分子及其对牛血清蛋白的分离（1）1mM的D-半胱氨酸与L-半胱氨酸溶液的配制：用分析天平分别称取1.2116mg的D-半胱氨酸与L-半胱氨酸于15mL离心管中，然后用移液枪移取10mL的去离子水，震荡溶解。其中D-半胱氨酸不易溶于水，需超声15min；（2）修饰金颗粒的AAO膜孔道内分别特异性的修饰D-半胱氨酸与L-半胱氨酸：将修饰有金纳米颗粒的AAO膜浸没于（1）中配好的溶液（每片约0.5mL）中，用锡箔纸包好，反应过夜。第二天取出，用去离子水冲洗几次，除去表面的残留溶液；再用去离子水真空抽洗5次；（3）0.05mol/LPH=7.4的PBS缓冲液的配制：用分析天平称取十二水合磷酸一氢钠（Na2HPO4）0.35814g，二水合磷酸氢二钠（NaH2PO4）0.078g，然后分别用20mL、10mL去离子水溶解。将两者以4:1的配比(取Na2HPO4溶液16mL，NaH2PO4溶液4mL)混合均匀，现配现用；（4）100nmol/L的带FITC荧光素BSA溶液的配制：用移液枪取2mg/mL的BSA原溶液17μL加入（3）中所配的PBS溶液5.083mL，震荡均匀；（5）BSA浓度曲线的滴定：取（4）中100nmol/LBSA溶液，加pH=7.4的PBS溶液稀释至50、25、10、5与1nmol/L五个浓度,然后用荧光光谱仪测出每个浓度下对应的荧光强度(其中激发波长为494nm,发射波长为521nm,狭缝宽度为5mm),测完每个浓度之后必须将装液体的池子用去离子水洗净吹干，才能进行下一次测量，之后用origin做出浓度-荧光强度曲线。（5）BSA分子的跨膜电化学驱动：BSA分子的跨膜电化学驱动的装置与3.1（8）中相同，但其中电解液为pH=7.4的PBS缓冲液，右侧驱动原液为100nmol/LBSA溶液，驱动时所用的膜为修饰D-半胱氨酸与L-半胱氨酸的AAO膜，其他条件相同。将BSA分子通过AAO空白膜、修饰有金颗粒的AAO膜的跨膜电化学驱动作为对比实验；（7）驱动液荧光强度的测定：测定BSA分子通过修饰有D-半胱氨酸与L-半胱氨酸的AAO膜、空白AAO膜、修饰有金颗粒的AAO膜所得到的四种驱动液荧光强度，分析修饰D-半胱氨酸与L-半胱氨酸的AAO膜对BSA分子的运输影响；三、实验结果与讨论3.1AAO膜孔道内修饰金纳米颗粒SEM形貌的表征聚多巴胺（PDA）是具有强粘附性与还原性的物质。本实验通过简单的真空抽滤的方法，将聚多巴胺附着在AAO孔道内，形成一层薄层。然后利用聚多巴胺的还原性将HAuCl4中的Au3+还原为Au原子，在AAO孔道内聚集形成金颗粒。并且通过扫描电子显微镜（SEM）对修饰金颗粒的AAO膜表面及孔道内的形貌进行了表征。SEM结果如下图3.1所示，AAO膜外表面基本没有金纳米颗粒，金纳米颗粒仅存在于孔道内部。修饰了金颗粒的AAO膜表面基本没有出现堵塞的情况，而呈现“开通”状态，证明修饰金颗粒并不会造成AAO表面堵塞，从而排除了表面形貌改变对修饰金颗粒的影响。在AAO孔道内，可以看出金纳米颗粒大多呈球粒状分散的分布在孔道内壁，且直径都略小于孔径，说明孔并未被完全的堵塞,由图3.1（C）可以看出金颗粒外有一层薄膜包附着，这层薄膜可能是PDA薄层。图3.1（A）金纳米颗粒修饰的AAO模板的顶部SEM图（B）金纳米颗粒修饰的AAO模板的底部SEM图（C）金纳米颗粒修饰的AAO模板的截面SEM图（白点为纳米金颗粒）3.2、不同PDA浓度、HAuCl4浓度对孔道内金颗粒尺寸及密度的影响3.2.1不同PDA浓度对金颗粒的尺寸及密度分布的影响PDA作为将Au3+还原为Au原子的还原剂，其浓度势必会影响孔道内金颗粒的生长尺寸与密度。为研究其影响，如实验操作2所示，本实验中选用浓度分别为2、20mg/mL的2种PDA溶液完成AAO膜孔道内金纳米颗粒的修饰，通过扫描电子显微镜（SEM）对修饰后的AAO膜孔道内进行表征，本工作中利用“NanoMeasurer”软件对孔道内金颗粒的尺寸及数量进行整体的统计。结果如下图3.2所示，一方面，随着PDA浓度从2mg/mL升高到20mg/mL，每个浓度下的SEM图片（表面积约为1.1·10-10·m-2）中金颗粒的平均数目分别为209和417个，对应的密度为1.9·1012和3.79·1012m-2提高了将近2倍，这由于PDA浓度升高，附着在AAO孔道内的PDA分子越多，从而还原产物金颗粒就越多。另一方面，随着PDA浓度从2mg/mL升高到20mg/mL，金颗粒的尺寸分别为41.7和34.4nm，呈下降的趋势。这是因为随着PDA浓度增加，还原剂的数量增加，所生成的金晶核增加，但HAuCl4中Au3+的浓度固定，所以导致金颗粒的尺寸下降。图3.2（A-B）PDA浓度分别为2mg/mL（A），20mg/mL（B）所对应的AAO膜孔道内金颗粒（AuNPs）分布的SEM图（C-D）PDA浓度分别为2mg/mL（C），20mg/mL（D）所对应的AuNPs尺寸分布图（E）金颗粒（AuNPs）尺寸及数目随PDA浓度变化统计表3.2.2不同HAuCl4浓度对金颗粒的尺寸及密度分布的影响为研究HAuCl4浓度对AAO膜孔道内金纳米颗粒生长尺寸及密度的影响，如实验操作2所示，本实验固定PDA浓度为2mg/mL，选用浓度分别为0.1mM、1mM、10mM的三种HAuCl4溶液完成AAO膜孔道内金纳米颗粒的修饰，并将修饰金颗粒的AAO膜在扫描电子显微镜（SEM）下进行金颗粒尺寸及分布密度进行表征，结果如下图3.3所示，随着HAuCl4浓度由0.1mM上升到10mM，每个浓度下的金颗粒数目为0、219和68个，对应的密度为0、2·1012与6.2·1011m-2。而每个浓度下的尺寸为0、41.7和62.3nm，当HAuCl4为0.1mM时，并没有Au颗粒的形成，这可能是因为Au3+的浓度太低，生成的Au原子太少，不足以聚集形成金颗粒。当HAuCl4浓度从1mM升至10mM时金颗粒密度下降了将近三倍，尺寸有明显增加。这是因为PDA浓度一定，还原剂浓度一定，而Au3+的浓度增大，导致金颗粒的密度下降，而粒径增大。图3.3（A-C）HAuCl4浓度分别为0.1mM（A）、1mM（B）和10Mm（C）对应的AAO膜孔道SEM图（D-E）HAuCl4浓度分别为1mM（D）和10mM（E）对应的AuNPs尺寸分布图（F）AuNPs尺寸及数目随HAuCl4浓度变化统计表3.2.3同时改变PDA、HAuCl4浓度对金颗粒的尺寸及密度分布的影响由以上实验可知，通过增大PDA浓度可以单向的提高AAO孔道内金纳米颗粒密度。反之，通过增大HAuCl4浓度可以单向的增大金颗粒的尺寸。为能够双向的调控金纳米颗粒的尺寸与密度分布，在AAO孔道内修饰尺寸大、密度高的金颗粒。本实验通过同时改变PDA、HAuCl4浓度为5mg/mL、2mM与PDA、HAuCl4浓度为2mg/mL、1mM对比，探究其对金纳米颗粒的尺寸与密度分布的影响，从而确定最佳PDA、HAuCl4浓度。实验结果如下图3.4所示，由图可知，当PDA、HAuCl4浓度为2mg/mL、1mM，对应的金颗粒尺寸与密度分别为41.7nm与1.9·1012m-2，当PDA、HAuCl4浓度为5mg/mL、2mM时，对应金颗粒的尺寸与密度分别为51.5nm与2.1·1012m-2，后者条件下的金颗粒尺寸与密度都大于前者，而且密度接近于PDA浓度为20mg/mL对应金颗粒密度，尺寸接近于HAuCl4浓度为10mg/mL对应的金颗粒尺寸，所以将PDA、HAuCl4浓度为5mg/mL、2mM作为本实验中修饰金颗粒的最佳条件。图3.4(A)PDA与HAuCl4为5mg/mL与2mM对应的AAO膜孔道SEM图(B)PDA与HAuCl4为2mg/mL与1mM对应的AAO膜孔道SEM图(C)PDA与HAuCl4为5mg/mL与2mM对应的AuNPs尺寸分布图(D)PDA与HAuCl4为2mg/mL与1mM对应的AuNPs尺寸分布图(E)AuNPs尺寸及数目随PDA与HAuCl4浓度变化统计表3.3、AAO孔道内选择性修饰疏水分子的表征及其对亲、疏水分子筛选本实验利用金原子与巯基反应生成稳定Au-S键的原理，将带巯基的二十二烷基硫醇（疏水分子）选择性的修饰在AAO膜孔道内的金颗粒上。并对其进行了接触角表征以及SEM形貌表征。并通过电化学驱动的方式，探究修饰疏水分子后的AAO膜对亲、疏水分子的分离筛选作用。3.3.1修饰二十二烷基硫醇的AAO膜的SEM孔道形貌表征实验通过SEM对修饰二十二烷基硫醇的AAO孔道及表面形貌进行表征，探究修饰二十二烷基硫醇后是否改变膜的孔道及表面的形貌特征。并将AAO空白膜、修饰金颗粒的AAO膜作为对比实验，结果如图3.5所示，在修饰金颗粒的AAO膜修饰正二十二硫醇疏水分子并未堵塞AAO膜的表面，而且其孔道内金颗粒的分布也与修饰金颗粒的AAO膜相似。说明在修饰金颗粒的AAO膜内修饰正二十二硫醇疏水分子并未改变膜表面与孔道内的形貌。图3.5(A)AAO膜孔道修饰金颗粒及二十二烷基硫醇示意图(B-C)AAO膜表面(B)与孔道(C)SEM图(D-E)修饰金颗粒的AAO膜表面(D)与孔道(E)SEM图(F-G)金颗粒上修饰二十二烷基硫醇的AAO膜表面(F)与孔道(G)SEM图3.3.2修饰二十二烷基硫醇的AAO膜的接触角表征实验通过对修饰二十二烷基硫醇的AAO孔道进行接触角测试，探究修饰二十二烷基硫醇后的AAO膜表面与孔道内的亲、疏水性质变化。结果如下图所示，图3.7为AAO、AAO-AuNPs、AAO-AuNPs-C22H46S三种膜的接触角随时间变化图，可以看出，修饰二十二烷基硫醇后，AAO膜表面接触角变大，说明表面变疏水。根据图3.8所示，在修饰金颗粒的AAO膜孔道内进一步修饰疏水分子二十二烷基硫醇，其接触角随时间的变化率进一步减小，当外界条件一致时，水分子难以渗透在金颗粒上修饰了二十二烷基硫醇的AAO孔道，说明由于二十二烷基硫醇的修饰，使得孔道内具有疏水性质。图3.7AAO、AAO-AuNPs、AAO-AuNPs-C22H46S三种膜的接触角随时间变化图图3.8AAO、AAO-AuNPs、AAO-AuNPs-C22H46S三种膜接触角归一化后随时间变化曲线3.3.3修饰二十二烷基硫醇的AAO膜对亲、疏水分子筛选本实验通过电化学驱动的方法，将亲疏水分子溶液作为驱动原液，测定电化学驱动后所得的驱动液的紫外吸收峰的吸收值，通过浓度曲线计算得出亲、疏水分子跨膜迁移的浓度，进行分析。如下图3.6所示，对于亲水分子亚甲基蓝，其紫外吸收峰出现在291nm与669nm(本实验取291nm作为吸收峰波长),并且浓度与紫外吸收值成正比。当将10-2mol/L亚甲基蓝作为原液进行驱动时，通过AAO空白膜的驱动液紫外吸收值平均为3.65，浓度为1.04·10-4mol/L；通过修饰金颗粒AAO膜的驱动液紫外吸收值平均为2.64，浓度为7.57·10-5mol/L；通过修饰二十二烷基硫醇AAO膜的紫外吸收值平均为1.09，浓度为3.22·10-5mol/L。由此可以看出，经过电化学驱动后，亲水分子亚甲基蓝在空白AAO膜孔道内迁移最快，驱动液浓度最大，在修饰金纳米颗粒的AAO膜孔道内迁移速度减慢，驱动液浓度随之下降，在修饰二十二烷基硫醇的AAO膜孔道内迁移速度进一步降低，驱动液浓度最小。这是由于在空白AAO膜孔道内无阻碍，亚甲基蓝分子迁移速度快。而在修饰金颗粒的AAO膜孔道内存在金纳米颗粒，堵塞了部分孔道，使空间位阻增大，减小了孔道有效内径，阻碍了亚甲基蓝分子的迁移。而在修饰二十二硫醇分子的AAO孔道内，二十二硫醇分子造成的孔道内的疏水效应进一步的阻碍亚甲基蓝分子的迁移。图3.6(A)不同浓度亚甲基蓝溶液对应的紫外吸收曲线(B)亚甲基蓝溶液浓度-紫外吸收值曲线(C)经过电化学驱动后分别通过AAO空白膜、修饰金颗粒AAO膜与修饰二十二烷基硫醇AAO膜对应的驱动液浓度柱状图如下图3.7所示，对于疏水分子阿米替林盐酸盐，其紫外吸收峰出现在239nm，浓度与紫外吸收值成正比。当将10-2mol/L的阿米替林盐酸盐做为原液进行电化学驱动时,通过AAO空白膜的驱动液紫外吸收值平均为0.82，浓度为6.4·10-5mol/L；通过修饰金颗粒AAO膜的驱动液紫外吸收值平均为0.09，浓度为9.1·10-6mol/L；通过修饰二十二烷基硫醇AAO膜的紫外吸收值平均为0.24，浓度为2.02·10-5mol/L，可以看出，经过电化学驱动后，疏水分子阿米替林在空白AAO膜孔道内迁移最快，驱动液浓度最大，在修饰金纳米颗粒的AAO膜孔道内迁移速度减慢，驱动液浓度随之下降，在修饰二十二烷基硫醇的AAO膜孔道内迁移速度提高，驱动液浓度相应增大。这是由于在空白AAO膜孔道内无阻碍，亚甲基蓝分子迁移速度快。而在修饰金颗粒的AAO膜孔道内存在金纳米颗粒，堵塞了部分孔道，使空间位阻增大，减小了孔道有效内径，阻碍了亚甲基蓝分子的迁移。而在修饰二十二硫醇分子的AAO孔道内，二十二硫醇分子造成的孔道内的疏水效应进一步的促进阿米替林分子的迁移。图3.7：(A)不同浓度阿米替林溶液对应的紫外吸收曲线(B)阿米替林溶液浓度-紫外吸收值曲线(C)经过电化学驱动后分别通过AAO空白膜、修饰金颗粒AAO膜与修饰二十二烷基硫醇AAO膜对应的驱动液浓度柱状图综上，在修饰金颗粒的AAO膜中修饰疏水分子二十二硫醇后，没有改变孔道内的结构形貌，但使孔道内具有疏水的性质，并且能够抑制亲水分子亚甲基蓝在孔道内迁移，促进疏水分子阿米替林的迁移。因此，该体系对亲、疏水分子具有筛选作用。3.4AAO孔道内选择性的修饰手性分子及其对BSA分子选择性运输本实验利用Au原子与巯基结合形成稳定的Au-S键的原理，在修饰金颗粒的AAO膜表面分别选择性的修饰上手性分子D-半胱氨酸与L-半胱氨酸，然后检测经两种手性分子修饰后的AAO膜在电化学驱动下对BSA跨膜运输的影响。实验测量BSA通过AAO空白膜、修饰金颗粒的AAO膜、修饰D-半胱氨酸分子的AAO膜与修饰L-半胱氨酸分子的AAO膜后分别所得的驱动液的荧光强度，通过BSA的浓度曲线计算出驱动液的浓度。本实验中BSA中的荧光素为FITC，其激发波长为494nm,发射波长为521nm。结果如下图3.8所示，通过修饰Au颗粒的AAO膜的BSA浓度最低，约为5.5nM，这是由于修饰Au颗粒使AAO膜的有效内径减小，空间位阻增大，阻碍了BSA分子的迁移。而进一步在修饰金颗粒的AAO膜中修饰上D-半胱氨酸分子与L-半胱氨酸，发现通过两种膜的BSA浓度都增大,分别为6.4nM与8nM，其中通过修饰L-半胱氨酸的AAO膜的BSA浓度与通过空白AAO膜的接近。而通过修饰D-半胱氨酸的AAO膜的BSA浓度最高，说明在修饰金颗粒的AAO膜中修饰上D-半胱氨酸与L-半胱氨酸，都能促进BSA在孔道内的运输，但两者的促进程度不同，D-半胱氨酸的促进程度明显高于L-半胱氨酸。所以在AAO孔道内修饰手性分子L/D-半胱氨酸，对BSA分子的运输展现出手性选择性，其中修饰D-半胱氨酸的AAO孔道更有利于BSA分子的跨膜运输。图3.8(A)不同浓度BSA溶液对应的荧光光谱曲线(B)BSA溶液浓度-荧光强度曲线(C)经过电化学驱动后BSA分别通过四种膜对应的驱动液荧光光谱图(D)经过电化学驱动后BSA分别通过四种膜对应的浓度柱状总结与展望生物孔道因其具有高度的选择性与特异性，被广泛的应用在分子的分离筛选、分子的检测领域，但因其稳定性的限制，设计和开发人工纳米孔道材料越来越受到人们的关注。相比于生物材料，无机纳米材料本身不仅具有稳定的物理性质、并且其形状和表面功能化可调控，这就为智能纳米孔道系统的设计和开发提供了良好的研究平台。目前以纳米孔道为基础在其孔道进行功能化修饰建立分子离子分离筛选体系已经成为相关领域科研人员的研究重点。本文通过在AAO孔道内进行功能化修饰，探究其对分子的分离筛选作用，主要得到了以下结论：（1）孔道内金纳米颗粒尺寸与密度的双向调控。本工作利用聚多巴胺粘附性和还原性的双重性质，结合氯金酸的强氧化性，采用真空抽滤的方法，在AAO纳米孔道的内壁成功修饰了分散的金纳米颗粒。此外，通过调节聚多巴胺溶液浓度，氯金酸浓度的条件，实现了AuNPs在纳米孔道内生长的可控性。本实验中金纳米颗粒生长的最佳浓度为PDA5mg/mL、HAuCl42mM；（2）孔道内修饰疏水分子对亲、疏水分子的分离筛选。利用Au原子与巯基结合形成Au-S键，在修饰Au颗粒的AAO膜修饰了疏水分子二十二烷基硫醇，经过电化学驱动，修饰了二十二烷基硫醇的AAO膜阻碍亲水分子亚甲基蓝的迁移，促进疏水分子阿米替林的迁移，从而实现了对亲、疏水分子的分离筛选。（3）修饰手性分子对蛋白质的选择性运输。利用Au原子与巯基结合形成Au-S键，在修饰Au颗粒的AAO膜选择性的修饰了D-半胱氨酸与L-半胱氨酸，经过电化学驱动，发现修饰了D-半胱氨酸的AAO膜比修饰L-半胱氨酸的AAO膜更容易通过BSA分子，对BSA分子的运输具有选择性。本实验制备的疏水分子功能化的AAO膜纳米孔道，阻碍亲水分子迁移，促进疏水分子迁移，对亲、疏水分子具有较好的分离筛选作用。但由于时间原因，没有进一步探究亲水分子功能化的AAO膜是否具有促进亲水分子迁移，阻碍疏水分子迁移的性质。后续研究可以在AAO膜中修饰亲水分子，探究其对亲、疏水分子的分离筛选。本实验制备的手性L-半胱氨酸与D-半胱氨酸功能化的AAO膜，虽然对BSA具有选择性运输，然而由于时间有限，很多影响条件尚未进行深入探讨，例如驱动时间、驱动电压、BSA浓度等，后续仍需深入探讨，进一步完善此实验。致谢转眼间，大学生活已经接近尾声。在大学这四年时光里，我的各种能力都得到了提高，综合素养得到了提升，这四年也必将成为我最美好的回忆。我相信大学四年我所学到的知识与能力对我今后的发展有莫大的帮助。在做毕业设计这段时间里，首先我想感谢学校，感谢学校给我们提供良好的实验平台。其次我特别想感谢我的指导老师——高鹏程教授，在我做毕设实验遇到困难时，高老师总是耐心地给我分析问题所在，并提出宝贵的意见。这样我的实验才能够顺利的完成。而且高老师对实验严谨的态度，对科研坚持的精神，令我感到钦佩，值得我用一生去学习。然后，我特别感谢带我的司志晓师兄，在我实验中，师兄认真的交我各种实验仪器与软件的使用方法，让我熟悉了各种仪器的基本操作。在我实验遇到问题时，师兄也竭尽所能的帮助我。无论实验上还是生活中，都给了我莫大的帮助。在这里，希望师兄实验有所突破，学业有成。最后，我想感谢全部支持我的人，包括朋友、家人、同学。希望你们健健康康。参考文献[1]李素娟.纳米孔道材料的限域性质及其在生物分析中应用[D].南京大学,2010.[2]MacaraIG.Transportintoandoutofthenucleus[J].MicrobiolMolBiolRev,2001,65(4):570-594.[3]MarforiM,MynottA,EllisJJ,etal.Molecularbasisforspecificityofnuclearimportandpredictionofnuclearlocalization.[J].BiochimicaEtBiophysicaActa,2011,1813(9):1562-77.[4]Holland,E.M,Braun,etal.Thenatureofrhodopsin-triggeredphotocurrentsinChlamydomonas.I.Kineticsandinfluenceofdivalentions[J].BiophysicalJournal,1996,70(2):924-31.[5]HaqueF,LiJ,WuHC,etal.Solid-StateandBiologicalNanoporeforReal-TimeSensingofSingleChemicalandSequencingofDNA[J].Cheminform,2013,8(1):56-74.[6]DeamerDW,BrantonD.Characterizationofnucleicacidsbynanoporeanalysis.[J].AccountsofChemicalResearch,2002,35(10):817-25.[7]&AmpHB,CremerPS.progressStochasticsensorsinspiredbybiology[J].Nature,2001,413(6852):226-230.[8]Liu,N.W,Datta,A,Liu,C.Y,etal.FabricationofAnodic-AluminaFilmswithCustom-DesignedArraysofNanochannels[J].AdvancedMaterials,2005,17(2):222-225.[9]MussiV,FanzioP,RepettoL,etal.DNA-functionalizedSi3N4nanoporebiosensors[C]//NationalNanomedicineConference.2009.[10]UmeharaS,PourmandN,WebbCD,etal.Currentrectificationwithpoly-l-lysine-coatedquartznanopipettes[J].Nanoletters,2006,6(11):2486-2492.[11]ZhangH,TianY,JiangL.Fundamentalstudiesandpracticalapplicationsofbio-inspiredsmartsolid-statenanoporesandnanochannels[J].NanoToday,2016,11(1):61-81.[12]NishizawaM,MenonVP,MartinCR.Metalnanotubulemembraneswithelectrochemicallyswitchableion-transportselectivity[J].Science,1995,268(5211):700-702.[13]PerryJL,GuoP,JohnsonSK,etal.Fabricationofbiodegradablenanotesttubesbytemplatesynthesis[J].Nanomedicine,2010,5(8):1151-1160.[14]NozawaK,OsonoC,SugawaraM.BiotinylatedMCM-41channelsasasensingelementinplanarbilayerlipidmembranes[J].Sensors&ActuatorsBChemical,2007,126(2):632-640.[15]LiJ,SteinD,McMullanC,etal.Ion-beamsculptingatnanometrelengthscales[J].Nature,2001,412(6843):166-169.[16]JirageKB,HulteenJC,MartinCR.Nanotubule-BasedMolecular-FiltrationMembranes[J].Science,1997,278(5338):655-658.[17]ChunKY,StroeveP.Proteintransportinnanoporousmembranesmodifiedwithself-assembledmonolayersoffunctionalizedthiols[J].Langmuir,2002,18(12):4653-4658.[18]JirageKB,HulteenJC,MartinCR.Effectofthiolchemisorptiononthetransportpropertiesofgoldnanotubulemembranes.[J].AnalyticalChemistry,1999,71(21):4913-8.[19]MubarakAli.FunctionalizationandApplicationofIonTrackEtchedNanochannelsinPolymerMembranes[D].Ph.D.Dissertation,2009.[20]NishizawaM,MenonVP,MartinCR.Metalnanotubulemembraneswithelectrochemicallyswitchableion-transportselectivity.[J].Science,1995,268(5211):700-702.[21]JillianLPerry,PengGuo,ShannonKJohnson,etal.Fabricationofbiodegradablenanotesttubesbytemplatesynthesis[J].Nanomedicine,2010,5(8):1151-1160.[22]KeiichiroNozawa,ChieOsono,andMasaoSugawara.BiotinylatedMCM-41channelsasasensingelementinplanarbilayerlipidmembranes[J].SensorsandActuatorsB:Chemical,2007,126(2):632-640.[23]GuoW,TianY,JiangL.Asymmetriciontransportthroughion-channel-mimeticsolid-statenanopores.[J].AccChemRes,2013,46(12):2834-2846.[24]TianY,WenL,HouX,etal.Bioinspiredion-transportpropertiesofsolid-statesinglenanochannelsandtheirapplicationsinsensing.[J].[25]HoworkaS,SiwyZ.Nanoporeanalytics:sensingofsinglemolecules[J].ChemicalSocietyReviews,2009,38(8):2360-2384.[26]MengH,LiuH,KuaiH,etal.ChemInformAbstract:Aptamer‐IntegratedDNANanostructuresforBiosensing,BioimagingandCancerTherapy[