荧光探针；过氧亚硝基阴离子；响应机理；活性氧

中文摘要在最近的这几年里，随着科学技术的进步与发展，小分子荧光探针由于具有较高的灵敏度、选择性好、生物兼容性良好等特点，慢慢地进入了科学研究者的视野。科研人员也意识到利用这种小分子荧光探针可以进入活生物体中对目标分子进行识别和影像，以及对目标分子的动态变化进行监控。因此，该技术广泛应用于化学分析、环境分析和生物分析领域，特别适用于对样品的实时监测和生物荧光成像，而且在研究生命历程、生命疾病、疾病的诊断方面发挥着巨大的优势，也给科研人员带来了一些重要启示。目前，设计并合成出能特异性追踪生物体内目标分子的荧光探针已经成为科研工作者的一个重要研究课题及关注热点，荧光探针也慢慢地成为研究生命领域的一种重要技术。过氧亚硝基阴离子（ONOO-）是生命系统中内源性产生的活性氧（ROS）之一，可以在各种生理和病理条件下在线粒体中产生，其在信号转导中起重要作用，并且还表现出抗微生物和抗菌活性。最近的证据表明，ONOO-与阿尔茨海默病，关节炎，癌症，自身免疫和炎症性疾病以及其他疾病有关。由于缺乏有效的方法来观察生命系统中ONOO-，所以科学家们也难以理解由ONOO-所引起的一系列疾病。荧光探针的出现很好地解决了这一难题。ONOO-荧光探针分子由于其选择性好、灵敏度高、对样品无破坏性，已经成为实时检测ONOO-的重要工具及手段。然而，设计并合成出选择性好且灵敏度高的ONOO-荧光探针已成为研究焦点；因此，本课题在查阅各种文献及资料的基础上，设计并合成出一种以6-羟基-2-萘甲醛为反应原料的ONOO-荧光探针，也通过各种仪器分析得出该探针能有效排除其他ROS的干扰，对ONOO-具有良好的选择性；与ONOO-反应能在紫外-可见光吸收光谱中370nm左右处出现了一个新的吸收峰且吸光度比较大；与ONOO-反应后荧光响应很强但由于自身荧光强，导致灵敏度并不高，这有待以后进一步改进。关键词：荧光探针；过氧亚硝基阴离子；响应机理；活性氧ABSTRACTInthepastfewyears,withtheadvancementanddevelopmentofscienceandtechnology,smallmoleculefluorescentprobeshaveslowlyenteredthefieldofscientificresearchbecauseoftheirhighsensitivity,goodselectivityandgoodbiocompatibility.Researchersarealsoawarethattheuseofthissmallmoleculefluorescentprobecanenterthelivingorganismtoidentifyandimagethetargetmolecule,aswellasmonitorthedynamicchangesofthetargetmolecule.Therefore,thetechnologyiswidelyusedinthefieldsofchemicalanalysis,environmentalanalysisandbioanalysis,especiallyforreal-timemonitoringofsamplesandbio-fluorescenceimaging,andithasgreatadvantagesinthestudyoflifehistory,lifediseases,anddiseasediagnosis.Broughtsomeimportantrevelationstoresearchers.Atpresent,designingandsynthesizingfluorescentprobesthatcanspecificallytracktargetmoleculesinorganismshasbecomeanimportantresearchtopicandfocusofresearchers.Fluorescentprobeshavegraduallybecomeanimportanttechnologyinthefieldofliferesearch.Peroxynitrite(ONOO-)isoneoftheendogenouslyproducedreactiveoxygenspecies(ROS)inthelivingsystemandcanbeproducedinmitochondriaundervariousphysiologicalandpathologicalconditions,whichplaysanimportantroleinsignaltransduction.Andalsoexhibitsantimicrobialandantibacterialactivity.RecentevidencesuggeststhatONOO-isassociatedwithAlzheimer'sdisease,arthritis,cancer,autoimmuneandinflammatorydiseases,andotherdiseases.BecauseofthelackofeffectivemethodstoobserveONOO-inthelivingsystem,itisdifficultforscientiststounderstandaseriesofdiseasescausedbyONOO-.Theemergenceoffluorescentprobeshassolvedthisproblemwell.ONOO-fluorescentprobemoleculeshavebecomeanimportanttoolandmeansforreal-timedetectionofONOO-duetotheirgoodselectivity,highsensitivityandnon-destructivenesstosamples.However,thedesignandsynthesisofselectiveandsensitiveONOO-fluorescentprobeshasbecomethefocusofresearch;therefore,basedonthereviewofvariousliteraturesandmaterials,thisprojectdesignedandsynthesizeda6-hydroxy-2-NaphthaleneformaldehydeistheONOO-fluorescentprobeofthereactionrawmaterial.ItisalsoanalyzedbyvariousinstrumentstofindthattheprobecaneffectivelyexcludeotherROSinterference,andhasgoodselectivitytoONOO-;andONOO-reactiveenergyinultraviolet-visiblelightAnewabsorptionpeakappearedatabout370nmintheabsorptionspectrumandtheabsorbancewasrelativelylarge.ThefluorescenceresponsewasstrongaftertheONOO-reaction,butthesensitivitywasnothighduetothestrongself-fluorescence,whichneedsfurtherimprovement.KeyWords：FluorescentProbe；Peroxynitrite；ResponseMechanism；ReactiveOxygenSpecies绪论1.1引言随着科学技术的进步，科学家们致力于研究人类的生命历程，对于人体生命系统的微观世界越来越着迷，通常会采用各种工具或手段更直观地观察生命系统中微观世界的生理变化。近几年来，荧光探针的快速发展给科研人员带来了启发，小分子荧光探针由于具有较高的灵敏度、选择性好、生物兼容性良好等特点，慢慢地进入了科学研究者的视野。科研人员也意识到利用这种小分子荧光探针可以进入活生物体中对目标分子进行识别和影像，以及对目标分子的动态变化进行监控。因此，该技术广泛应用于化学分析、环境分析和生物分析领域，特别适用于对样品的实时监测和生物荧光成像，而且在研究生命历程、生命疾病、疾病的诊断方面发挥着巨大的优势，也给科研人员带来了一些重要启示。目前，设计并合成出能特异性追踪生物体内目标分子的荧光探针已经成为科研工作者的一个重要研究课题及关注热点，荧光探针也慢慢地成为研究生命领域的一种重要技术。过氧亚硝基阴离子（ONOO-）是生命系统中内源性产生的活性氧（ROS）之一，可以在各种生理和病理条件下在线粒体中产生，其在信号转导中起重要作用，并且还表现出抗微生物和抗菌活性。过氧亚硝基阴离子（ONOO-）代谢产物为羟基自由基和二氧化氮自由基。在生物系统中，ONOO-的半衰期为10-20ms。通过离子通道，它可以随意通过生物膜。在细胞中产生的ONOO-可以通过氨基酸残基中的硫醇氧化，络氨酸的硝化，蛋氨酸的氧化，色氨酸的氧化和硝化来修饰蛋白质并改变它们的活性，从而损伤核酸DNA、蛋白质和脂类，导致细胞凋亡。最近的证据表明，ONOO-与阿尔茨海默病，关节炎，癌症，自身免疫和炎症性疾病以及其他疾病有关。因此，用于检测具有高生物相容性和位点特异性的ONOO-的选择性和灵敏方法的开发将非常重要并且有助于阐明ONOO-的生物学作用。ONOO-荧光探针分子由于其选择性好、灵敏度高、对样品无破坏性，已经成为实时检测ONOO-的重要工具及手段。然而，设计并合成出选择性好且灵敏度高的ONOO-荧光探针已成为研究焦点之一。1.2荧光原理简介荧光和磷光一样，都是光致发光所产生的冷光。产生过程如图1.1所示，磷光材料处于基态（S0），当用特定波长的光照射时电子会吸收能量会通过非辐射跃迁系间窜越（ISC）回到第一激发三重态（T1），再经过振动弛豫（VT）回到最低能级的第一激发三重态（T1），通过辐射跃迁释放光子回到基态（S0）然而，荧光却不一样，电子会吸收能量并跃迁到激发态，处于高能量激发态的电子很快的通过非辐射跃迁振动弛豫（VT）和内转化（IC）的方式回到第一单重激发态（S1），然后通过辐射衰变释放出光子回到基态（S0）。图1.1荧光和磷光产生过程示意图1.3荧光探针的特性在一般情况下，荧光探针大多数应用于生物体内，因此，理想状态下的荧光探针应具备以下特征：第一，荧光探针无毒无害，pH与生物体相近且具有生物相容性；第二，荧光探针不能干扰生物体，不能影响其正常功能的运行；第三，探针所发出的荧光要有区分度，不能与生物体的背景荧光混淆。然而，在探针的标记过程中，生物荧光探针的荧光特性会受到生物学主体的许多因素的干扰。另外，荧光探针的引入将不可避免地对检测系统的原始状态产生或多或少的影响。例如，如果在用荧光染料标记后每种抗体结合超过四个荧光基团，则抗体的亲和力通常会降低。1.3.1荧光探针的选择原则①荧光的定性与定量当进行定性实验研究时，应更多的选择单波长激发探针；但是，进行定量实验研究时，则应选择双波长激发比率型探针。②荧光探针的特异性与毒性因为探针作用于生物体内，应尽可能选择无毒或低毒性的和高特异性的探针。但是并非所有荧光探针都是特异性的，一般具有特异性的荧光探针都有以下特征：其荧光团与目标分子是具有特异性识别作用的配体或者是化学官能团。通常包括抗原-抗体，生物素-抗生物素，酶-底物，叶酸-叶酸受体等。③荧光探针适用的pH通常，荧光探针应适合于生理条件下的pH环境要求。当探针在非生理条件下使用时，应根据pH要求进行适当的选择，在制备溶液时也应注意这一点。④激发波长和发射波长由于电子在跃迁期间吸收或发射的能量会受到电子能级的限制，所以只能吸收或者发射特定波长范围内的光。激发波长主要在近紫外或可见光区域内，发射波长主要在可见光区域内，所以激发波长和发射波长决定了光源的选择。例如，如果染料的激发波长在紫外区域，则必须使用紫外光源。最常用的光源是汞灯（主峰为366mm、405nm，436mm，546nm和575nm），氙灯（连续光），氩离子激光器（458m、488nm和514nm），氩-氪激光器（488mm，568nm和647m）和氦-氖激光器（543nm，594nm和633nm）。⑤荧光强度荧光强度的大小决定了探针检测的灵敏度高低，由探针的摩尔吸光系数和荧光的量子产率共同影响，当条件在确定的情况下，两者都为定值。当探针与目标分子结合时，其量子产率值应大于或者接近0.4，否则没有任何有效的价值。⑥荧光寿命分子处于激发态的平均时间，称为荧光寿命。探针极长的荧光寿命对于高灵敏度的检测有着重要作用。⑦光稳定性为了有效提高荧光信号的强度可以适当增加激发光的强度，但光强度超过一定的极限会出现光漂白现象。对于荧光显微镜，出现光漂白现象会严重影响到测量结果，为此，增加检测探针的灵敏度可以在有效提高荧光强度的同时，降低光强度，避免出现光漂白现象。1.4小分子荧光探针的简介1.4.1小分子荧光探针的结构一般来说，小分子荧光探针由三部分组成：接受体、连接基团（中继体）和荧光团。接受体作用于目标分子，负责追踪识别目标分子；连接基团相当于一个连接臂，负责把接受体与荧光团连接起来；荧光团是一个重要的部分，作为一个光学信号的信号源，对识别作用做出响应并且发出荧光信号。检测机制是通过小分子荧光探针与靶分子的相互作用来改变荧光光谱，从而达到检测目标化合物的目的。这些变化包括荧光寿命，荧光激发和发射波长，荧光强度，荧光共振/各向异性等。如图1.2所示，目前大多数的有机小分子荧光探针都是以这种模式构建。图1.2小分子荧光探针构建示意图依据上述的设计原理，再根据接受体与底物类别的不同可以分为三类。第一类，通过配位作用，探针分子的接受体识别底物目标分子，生成配合物，导致影响探针分子的光学性质（图1.3a）。根据文献报道，这种作用包括静电吸引，范德华力，配位键，氢键，偶极-偶极相互作用等。在设计荧光探针的初期，就是使用这种弱相互作用来改变探针分子的性质（波长，强度，荧光寿命）。这种探针的优点在于探针分子和目标化合物之间的相互作用是可逆的，可用于检测生物靶分子的动态变化。然而，这种荧光探针通常不敏感且不特异。例如，溶液检测系统的极性变化将导致弱相互作用的巨大变化，特别是在水溶液中，如氢键，配位键等其他效应将变得非常弱，导致这种类型的荧光探针灵敏度比较低。第二类，利用探针分子与底物目标分子发生化学反应，即反应型探针，生成新的化合物，从而改变探针的分子结构与原始光学性能，以达到识别目标分子的目的（图1.3b）。这种强相互作用可以改变探针分子取代基的电子供体和吸引能力，探针结构的共轭度和探针螺旋环的开关环等，从而改变探针系统的荧光性能并实现确定目标分析物的目的。这种探针的优点是探针与靶分子发生不可逆的化学变化，从而可以充分积累反应后的荧光强度，提高荧光探针的灵敏度。然而，这种类型的探针不能用于监测生物靶分子的动态变化。反应荧光探针一直受到全世界科学家的青睐，特定的化学反应已广泛用于改善荧光探针检测靶分子的性能。第三类，当探针的接受体识别到底物目标分子，底物置换出探针的荧光团，荧光团可以恢复自身的光学性质，发出荧光，从而达到识别特定目标分子的作用（图1.3c）。图1.3小分子荧光探针的三种探针类型1.4.2小分子荧光探针的响应机理小分子荧光探针的响应机理主要有：光诱导电子转移（PET）、分子内电荷转移（ICT）、荧光共振能量转移（FRET）、激发态分子内质子转移（ESIPT）、通键能量转移（TBET）。1.4.2.1基于ICT的比率荧光探针基于内部电荷转移（ICT）的探针的特征在于与一个分子内的电子接受单元缀合的电子给体单元，其在激发态下产生“推-拉”π-电子系统。它们已被广泛用于阳离子传感。在给电子部分与阳离子相互作用时，探针的给电子特性降低。这导致吸收光谱的蓝移。相反，当阳离子与电子接受部分相互作用时，由于ICT变得更加发达，在吸收光谱中观察到明显的红移。此外，还可以观察到荧光量子产率和寿命的变化。早期由Valeur引入了阳离子传感的ICT战略，从那时起，基于比率检测的各种基于ICT的荧光分子已被用于目标分析物的成像。例如，Tsien等人设计的基于ICT的探针可以对H+，Na+和Mg2+以及Ca2+离子进行生理监测。Nagano课题组等人设计的比率Zn2+探针，称为ZnAF-R1，ZnAF-R2，ZnIC和DIPCY。细胞膜可渗透探针ZnAF-R2和ZnIC也用于监测活细胞中的Zn2+浓度。塔基课题组等人开发了一种比率Cd2+传感器CadMQ，相对于其他重金属离子和过渡金属离子，包括水介质中的Zn2+，它具有优异的Cd2+选择性。该探针可以有效地用于活细胞中Cd2+的比率传感。在开创性工作中，Shinkai和James团队已经制备了糖类传感ICT探针，这些探针在现实世界的应用中仍具有前景。另外，通过结合香豆素和部花青酸构建的混合荧光团被开发用于比例感测H2S。该探针由于其ICT特性而显示出强吸收带。它显示分别由香豆素和部花青亚基产生的两个良好分辨的发射带。在H2S存在下，部花青的排放强度降低，而香豆素的强度增加。当溶解在磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.4）中时，发现溶液颜色在暴露于H2S时从深蓝色变为非常浅的蓝色。通过两个发射带的强度比确定H2S的检测极限，并且发现其为约1mM。此外，该特定探针优先定位于线粒体中并允许细胞内H2S的实时成像。1.4.2.2基于ESIPT的比率荧光探针激发态分子内质子转移（ESIPT）通常涉及在荧光团的激发态下从羟基（或氨基）单元到羰基氧（或亚胺氮）原子的快速质子转移。例如，2-（20-羟基苯基）苯并恶唑（HBO）优选以烯醇形式（E）存在，并且通过基态的分子内六元环H-键合基序稳定。在320nm激发后，由于ESIPT，激发的烯醇形式（E*）转化为激发的酮互变异构体（K*）。该过程产生具有大斯托克斯位移的发射带（~500nm）。在衰变至基态后，酮形式（K）通过反向质子转移返回到烯醇形式。不经历ESIPT的其他激发的烯醇分子通常在较高能量（例如，~430nm）下显示发射带。在许多条件下，ESIPT荧光团显示两个来自烯醇和酮形式的发射带。这些波段相对强度的变化可为比率传感系统提供基础。通过分子间氢键相互作用或溶剂极性变化对分子内排列的扰动已得到广泛研究。此外，环境光学特征中的相关调制为ESIPT染料的若干应用提供了背景，包括分析化学中的极性敏感探针，分子逻辑门，发光材料，聚合物科学中的读出元件，胶体化学中的标记和生化标记。其他几种ESIPT染料，包括2-（20-羟基苯基）-苯并恶唑（HBO），2-（20-羟基苯基）苯并噻唑（HBT），N-（3-（苯并[d]噻唑-2-基）-4-（羟基苯基）苯甲酰胺）（3-BTHPB）和3-羟基黄酮（3HF）已被开发为比率荧光探针。例如，Demchenko和Mely设计了基于3HF的ESIPT探针，其用作荧光生物膜探针，其允许比率检测细胞凋亡。Peng课题组等人设计并合成了基于HBO的ESIPT探针，用于检测氟离子和乙酸根离子。金属离子结合也可引发ESIPT效应。例如，Pang等人设计出了基于HBO的荧光探针，在Zn2+离子络合作用下产生ESIPT发射。在其他研究中，Kim课题组等人报道了一种基于HBT的探针，它通过磷酸化HBT羟基来抑制ESIPT，从而产生烯醇衍生的发射特征。然而，选择性酶促（MKP-6;蛋白酪氨酸磷酸酶）水解后，发生ESIPT以产生基于酮基于互变异构体的发射。类似地，发现其中羟基被叔丁基二苯基氯硅烷保护的探针（BTTPB）对于胶束混合物中的氟阴离子检测是有效的。观察到ppb水平的灵敏度，并且易于制备的测试纸的扩展证明易于生效。遗憾的是，基于ESIPT的比率检测在某些情况下证明是有限的，因为探针在水介质中的简单质子化会产生意外的和非分析物依赖性荧光变化。1.4.2.3基于FRET/TBET的比率荧光探针荧光共振能量转移（FRET）和自发能量转移（TBET）机制分别涉及作为能量供体和受体的一对荧光团之间的能量转移。应用于传感应用中，发射相对较短波长的供体用于激活较长波长的受体发射，这两种发射的比例由目标分析物调节。供体发射和受体吸收带之间的基本光谱重叠通常需要显示出高FRET效率。由于这种光物理要求，基于FRET的二元体通常通过非共轭间隔物与通过空间发生的能量转移相连。由于Stryer和Haugland利用FRET作为“光谱尺”，FRET已成为分析DNA结构，核酸调控，蛋白质结构，功能分析和免疫测定的重要工具。在基于TBET的二元体的情况下，供体和受体通过电子共轭键连接。这可以防止供体和受体片段变成平面。因此，能量转移可以通过连接键或键而不需要光谱重叠。在这些开创性的努力之后，许多基于FRET/TBET的荧光探针已被提出用于金属阳离子的比率检测。金属离子，例如Hg2+，Pb2+，Ag+和Cu2+，通常通过电子转移或重金属离子效应作为激发态猝灭剂。结果，探针的荧光被淬灭。在早期的工作中，Akkaya课题组等人设计了几个具有π-扩展BODIPY衍生物的基于FRET的“盒”，并证明了它们在Hg2+离子传感中的应用。在Hg2+离子存在下，能量转移效率得到提高。这种增加产生荧光发射特征的相关比例变化。Burgess课题组等人报告了TBET盒的设计概念，可用于许多分子生物学和生物技术应用。在一项概念验证研究中，涉及一系列带有BOPIPY基供体和花青受体的TBET分子，Burgess小组证明，在激发BODIPY部分时，激发能通过乙炔桥转移到花青染料受体上，发现发射波长取决于花青受体的结构，并且可以在约600至800nm的范围内变化。因此，这为成像提供了大的光谱窗口，并且被认为是有用的特征。这组探针可以封装在磷酸钙-硅酸盐纳米粒子中，可以自由分散在水中，并应用于细胞内成像磷酸钙-硅酸盐纳米粒子，可以在水中自由分散并应用于细胞内成像。在典型的FRET系统中，罗丹明的开环用于通过诱导来控制开启信号。供体染料的发射和罗丹明受体的吸收之间的光谱重叠。迄今为止，已经报道了许多基于罗丹明的FRET传感器。这些包括用于Cu2+感应的罗丹明-丹酰基二元体，用于一氧化氮和HOCl检测的罗丹明香豆素二元体，用于Hg2+感测的罗丹明-BODIPY二元体或用于分析含巯基的分析物，例如半胱氨酸等。这些系统中的一些已经被用于影响活细胞中某些分析物的比率成像。当用于TBET系统时，罗丹明开环过程激活了通过键能量转移事件。Tan课题组等人已经开发了这种方法，他开发了一种基于罗丹明的双光子TBET探针，可以对活细胞和组织进行双光子成像。该系统允许高分辨率比率成像，具有良好的组织穿透性（最大180mm）。1.4.2.4基于单体-准分子的比率传感探针准分子是由激发态荧光团与基态相同结构的荧光团的p-轨道相互作用形成的复合物，激发子的形成是由激发驱动的，也是由组分的局部浓度驱动的。准分子的发射特征不同于单体发射（未复合的荧光团）的发射特征，并且通常以红移波长和缺乏振动结构（导致宽发射带）为特征。基于这些差异，分析物驱动的准分子的分离和相对取向的变化可导致单体和准分子排放的比例差异。研究良好的荧光团芘被认为是基于准分子的分析物检测中最有用的传感分子之一。其特征在于370-380nm的单体发射和460-480nm的准分子发射。迄今为止，许多研究小组报告了基于芘的金属离子探针，磷酸盐或含磷酸盐的生物分子，如细菌alarmone（p）ppGpp和腺苷-5-三磷酸（ATP）。1.4.3小分子荧光探针的研究进展近年来，荧光探针由于其简单，方便和可广泛用于化学，生物和环境中而受到相当多的关注。到目前为止，荧光探针在生物体方面已经检测了许多重要的离子。1.4.3.1用于检测羟基自由基的新型比率荧光探针•OH是最有害的细胞内ROS之一，可对生物大分子（包括核酸，蛋白质，脂类和碳水化合物）造成严重损害。为了充分了解•OH的生物学作用，人们强烈希望利用高度选择性和敏感性的方法来监测其生命系统的生成，分布和动态波动。然而，由于高反应性，短寿命（体内：t1/2=10-9秒）和细胞浓度低，内源性•OH的监测极具挑战性。在过去的几十年中，已经开发了几种用于检测•OH的技术，例如电子自旋共振（ESR）光谱，色谱，分光光度法和电化学传感。。然而，这些方法仅适用于体外•OH测量。近年来，已有几种报道的荧光探针用于生物系统中的•OH检测，使用小分子或纳米材料荧光团。尽管如此，大多数报道的探针都是基于强度的探针，它们感知•OH只有荧光强度的光信号变化，很容易受到许多因素的影响，如仪器效率，环境变化（pH，极性，温度等等））和探针分布。相反，比率荧光探针更有利，因为它们可以通过内置校正两个发射带来消除干扰信号输出的大多数或所有因素。到目前为止，已经报道了一些用于•OH的比率荧光探针，然而，其中一些具有一些缺点，例如差的灵敏度和成像选择性•OH优于其他ROS。在此基础上，Wu课题组等人设计并合成了一种用于监测羟基自由基（•OH）的新型比率荧光探针4（图1.4）。探针4利用二氰基乙烯基作为新的反应位点并显示出NIR发射。用•OH处理后，探针4得到香豆素衍生物，并且在发射中显示出160nm的极大蓝移，在水性介质中具有~826倍的OH响应比信号增强。探针4对•OH具有高选择性，几乎不受其他ROS/RNS物种的干扰。此外，探针4已成功应用于以比率荧光成像方式监测LPS处理的SMMC-7721细胞中产生的内源性•OH。因此，探针4是用于发现•OH相关生物过程的有用工具。图1.4探针4的传感机理图1.4.3.2用于检测ClO-的荧光探针作为一类活性氧（ROS），次氯酸盐（ClO-）/次氯酸（HClO）在生理过程中起着至关重要的作用，可以在催化作用下由过氧化氢和氯离子产生。此外，它在生物系统中也很重要，但不适当摄入ClO-最终会导致氧化应激和神经退行性疾病，如帕金森病（PD），阿尔茨海默病（AD），甚至癌症。因此，对生物系统中ClO-的鉴定和研究具有重要意义。Wang课题组等人报道了用于选择性检测ClO-的水溶性红色发光探针1（图1.5）。探针1对ClO-显示出良好的灵敏度，检测下限为2.41nM。共聚焦显微镜的结果显示探针1可以在活细胞中追踪外源和酶促产生的ClO-。高选择性和敏感的红色荧光探针将是一个很有前途的工具，用于说明ClO-在生命系统中的功能。图1.5探针1的传感机制图此外，Tang课题组等人基于氰基联苯衍生物和二氨基马来腈基团设计了针对ClO-的比率荧光和比色探针1（图1.6）。探针1对次氯酸盐显示出独特的光学选择性，并且其他常见阴离子或活性氧物质的存在不会干扰检测结果。在H2O分子的共同作用下，ClO-的加入诱导了探针分子中腙键的断裂，伴随着游离荧光团的释放，产生荧光从红色到绿色的显着变化。研究人员还进行了生物实验和真实水试验，均表明探针1具有极好的实用性。这实验的设计方法为比率传感装置的构造提供了一些有用的信息。图1.6探针1与ClO-的反应过程图1.4.3.3用于检测Hg2+的荧光探针众所周知，重金属和过渡金属（HTM）离子的检测在化学，生物学和环境的广泛领域具有重要意义。水溶性二价汞离子（Hg2+）是HTM离子中最重要的，因为它具有臭名昭着的毒性和普遍性。Hg2+离子即使在非常低的浓度下也会引起几种严重的疾病，如脑损伤，胃肠系统疾病，肾病和神经系统疾病，因为它们很容易通过皮肤或食道进入体内。因此，开发用于检测Hg2+离子的简单方法受到了极大的关注。Yuan课题组等人报道了荧光探针BAA的简单合成策略（图1.7）。为了提高探针对Hg2+的结合能力和选择性，在探针的偶氮基团的相邻位置引入炔基。频谱分析表明BAA表现出高选择性开启荧光信号且能够在宽pH范围（3-10）内检测Hg2+，并表现出对Hg2+（约10秒）的快速响应特征。同时，实验发现，BAA仅在Hg2+存在下显示绿色荧光发射。探针BAA优异的膜参透性也使它成功用于通过共聚焦荧光成像检测MCF-7活细胞中的Hg2+。这里探索的轻便“开启”Hg2+荧光探针可能在环境测试，生物医学和食品分析方面具有进一步的潜在应用。图1.7探针BAA的合成路线1.5过氧亚硝基阴离子的简介过氧亚硝基阴离子（ONOO-）是生命系统中内源性产生的活性氧（ROS）之一，可以在各种生理和病理条件下在线粒体中产生，其在信号转导中起重要作用，并且还表现出抗微生物和抗菌活性。过氧亚硝基阴离子（ONOO-）代谢产物为羟基自由基和二氧化氮自由基。在生物系统中，ONOO-的半衰期为10-20ms。通过离子通道，它可以随意通过生物膜。在细胞中产生的ONOO-可以通过氨基酸残基中的硫醇氧化，络氨酸的硝化，蛋氨酸的氧化，色氨酸的氧化和硝化来修饰蛋白质并改变它们的活性，从而损伤核酸DNA、蛋白质和脂类，导致细胞凋亡。最近的证据表明，ONOO-与阿尔茨海默病，关节炎，癌症，自身免疫和炎症性疾病以及其他疾病有关。1.6过氧亚硝基阴离子荧光探针的研究进展1.6.1基于氢醌的双光子荧光探针Yang课题组等人开发了一种含有4-羟基苯胺部分作为ONOO-识别受体的新型荧光探针，但该探针容易受到包括羟基（•OH）和次氯酸（HOCl）在内的活性氧（ROS）的干扰。Kim课题组等人已经开发出具有硼酸频哪醇酯识别单元的荧光探针用于ONOO-，但这种硼酸盐识别部分已经被证实可以检测相关的ROS（即H2O2，OCl-）。此外，Wang课题组等人已开发出一种新型酮酰胺类荧光探针用于体内监测ONOO-，但酮酰胺的识别动力可用于设计用于检测H2O2的荧光探针。因此，开发用于检测ONOO-的特定荧光探针而没有ROS的干扰仍然是具有挑战性的。为此，Zhu课题组等人设计并合成了一种简单的4-羟基萘酰亚胺衍生的双光子荧光探针TPHQ（如图1.8），用于检测ONOO-。图1.8TPHQ双光子荧光探针为了检验探针TPHQ是否能够特异性地跟踪复杂生物系统中的细胞内ONOO-水平，Zhu等人加入较高浓度的H2O2（20倍ONOO-），但不能引起明显得荧光增强；而加入较高浓度的OCl-（20倍ONOO-）仅导致非常少的荧光增强，这些结果证实探针TPHQ对ONOO-具有出色的选择性，而不受H2O2和OCl-的干扰，这可能归因于ONOO-对氢醌的强氧化性比H2O2和OCl-更强。另一方面，上述数据间接证明了氢醌部分是ONOO-的优选识别受体，具有优于H2O2和OCl-的特异性。通过文献光谱结果可知，探针TPHQ和ONOO-的反应导致氢醌部分的去除，结果释放出4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺荧光团。通过HRMS分析可证实4-羟基-1,8-萘二甲酰亚胺荧光团的产生。TPHQ探针传感机制如图1.9。图1.9TPHQ荧光探针传感机制图示含有氢醌部分的新识别受体的探针TPHQ相对于其他各种生物相关分析物（包括H2O2和OCl-）表现出对ONOO的特异性。另外，探针TPHQ能够快速且灵敏地监测ONOO-。最后，具有低细胞毒性和令人满意的细胞膜渗透能力的探针TPHQ成功应用于活细胞中ONOO-水平的监测。这些结果使得探针TPHQ成为揭示ONOO-的多种病理生理学的有希望的候选者。1.6.2基于罗丹明衍生物和酰肼反应基团的荧光探针Yang课题组等人使用酰肼作为反应基团描述了罗丹明B基荧光探针I用于ONOO-。然而，没有测试该探针被次氯酸盐（ClO-）干扰。此外，Zhang课题组等人报道了荧光探针II，其中包含双反应位点，可以同时检测不同通道中的羟基自由基（•OH）和次氯酸（HClO）。但是，酰肼作为反应用于检测HClO，其功能不受ONOO-的干扰。因此，Wu课题组等人通过适当选择合成的荧光团来调节酰肼基团的反应性，开发了一种新的罗丹明衍生物荧光探针1，用于检测通过酰肼基团反应起作用的ONOO-。与其他ROS/RNS相比，该探针对ONOO-显示出高灵敏度和选择性。探针1和ONOO-的反应产物显示长波长吸收（600nm）和发射（638nm）带。另外，该探针用于成像HeLa细胞中的外源ONOO-和RAW264.7细胞中的内源性ONOO-以及小鼠感染模型的嗜中性粒细胞。1.6.3基于氢醌的特异性荧光探针Gal-NHP由于内部环境的复杂性和高自发荧光，开发用于在生命系统中追踪ONOO-的细胞特异性荧光探针仍然是一个巨大的挑战。Liu课题组等人利用羟基萘二甲酰亚胺作为荧光团和氢醌部分作为响应受体，开发了一种附加半乳糖的肝癌特异性荧光探针Gal-NHP，用于灵敏地检测活HepG2细胞中的内源性ONOO-。探针Gal-NHP可选择性地追踪ONOO-而不受来自其他物种如HOCl和H2O2的干扰。此外，半乳糖的引入增强了该探针的水溶性，并且Gal-NHP可以在水溶液中快速响应ONOO-。定量实验表明该探针具有良好的线性关系，具有良好的灵敏度。最重要的是，荧光成像结果显示它具有优异的肝癌特异性能力，可以实时成功检测内源性ONOO-肝癌细胞。因此，这种新开发的探针将有益于揭示ONOO-在肝细胞瘤细胞中的作用。1.6.4基于罗丹明的荧光探针RPTPP对于活细胞，ONOO-主要在线粒体内产生，因此，监测线粒体ONOO-将为其形成和功能提供更直接的视角。然而，能够敏感地和选择性地检测线粒体中的ONOO-的荧光探针仍然是罕见的，对于此现象，Li课题组等人设计并合成了线粒体可靶向荧光探针RPTPP（图1.10）。该荧光探针使用罗丹明作为稳定且高量子产率的荧光团，苯肼作为识别部分，三苯基鏻阳离子作为线粒体靶向部分。在探针与ONOO-反应后，通过ONOO-氧化苯肼并随后水解打开非荧光螺环结构，从而触发荧光开启响应，这种高灵敏度的荧光反应可用于监测线粒体ONOO-的变化。图1.10荧光探针RPTPP响应机制图1.7本课题研究目的在生命系统中，ONOO-扮演着一个重要的角色，它的产生或多或少会给人体带来危害，对ONOO-进行实时检测可以有效研究ONOO-在生命系统中作用机理，有助于对ONOO-相关疾病的控制。而荧光探针由于灵敏度高、可实时检测、对生物无破坏性等优点，用于检测ONOO-已成为目前研究热点。随着ONOO-探针的不断被报道，设计高灵敏度且选择性好的探针仍是研究重点。本课题在查阅各种文献及资料的基础上，设计并合成出一种以6-羟基-2-萘甲醛为反应原料的ONOO-荧光探针，并通过各种仪器分析该探针对ONOO-的选择性以及灵敏度高低，并为以后的研究工作提供实践基础。过氧亚硝基阴离子荧光探针的设计合成与分析2.1实验部分2.1.1主要仪器仪器名称生产商荧光光谱仪德国斯派克核磁共振波谱仪德国布鲁克pH计上海博取仪器有限公司旋转蒸发仪上海亚荣磁力搅拌器上海知性实验仪器技术有限公司手提式紫外分析仪上海嘉鹏科技有限公司分析天平日本岛津低温冷却循环泵上海知性实验仪器技术有限公司紫外-可见光分光光度计日本岛津2.1.2主要试剂试剂名称纯度生产商6-羟基-2-萘甲醛分析纯浙江明锋Tf2O（三氟甲磺酸酐）分析纯南京邦诺生物科技有限公司吡啶分析纯天诚化工有限公司联硼酸频那醇酯分析纯上海蓝润化学有限公司1,4-二氧己环分析纯江苏森萱医药化工有限公司石油醚分析纯天津市富宇精细化工有限公司二氯甲烷分析纯天津市富宇精细化工有限公司乙酸乙酯分析纯天津市富宇精细化工有限公司甲醇分析纯天津市富宇精细化工有限公司氩气太原钢铁集团DPPF-PdCl2催化剂分析纯湖北鑫鸣泰化学有限公司2.1.3目标化合物的合成2.1.3.1探针L3的合成路线探针L1的合成路线是使用化合物L1（6-羟基-2-萘甲醛）作为反应原料，加入Tf2O（三氟甲磺酸酐），与Tf2O（三氟甲磺酸酐）反应生成中间产物L2，然后，在Ar环境下，再用中间产物L2与L4反应，生成最终探针产物L3，产率为60%。2.1.3.2化合物L2的合成称量888mg化合物L1（6-羟基-2-萘甲醛）于圆底烧瓶，依次加入25ml二氯甲烷（不溶）和0.5ml吡啶，在冰浴条件下加入0.96mlTf2O（三氟甲磺酸酐），然后，把溶液放在磁力搅拌器上过夜反应（在常温条件下）。次日在溶液中加入二氯甲烷溶解，分离出有机相和水相；用二氯甲烷萃取水相2次，并收集有机相。将全部有机相用饱和NaCl溶液洗涤3次，随后用无水Na2SO4干燥，过滤后用旋转蒸发仪减压旋干溶液，采用层柱析分离法（乙酸乙酯：石油醚=1:4）分离收集得到化合物L2溶液，然后减压旋干溶液得到固体中间产物L2835mg。2.1.3.3化合物L3的合成称量固体中间产物L2（426mg）、化合物L4（540mg）、NaOAc（1.15g）和DPPF-PdCl2催化剂（102mg），将它们混合抽真空，并且通入Ar；在Ar的保护下通入无水1,4-二氧己环溶剂溶解混合物；加热到105℃，回流反应24小时。然后冷却到室温，用饱和NaCl溶液洗涤3次，分液后用无水Na2SO4干燥有机相，接着过滤后用旋转蒸发仪减压旋干液体，采用层柱析分离法（乙酸乙酯：石油醚=1:4）分离收集得到化合物L3溶液，然后减压旋干溶液得到最终产物L3，产率为60%。1HNMR（300MHz,CDCl3）：δ10.17（s，1H），8.41（d，j=24Hz，1H），7.95（s，4H），1.40（d，j=51Hz,12H）。图2.1最终产物L3的1HNMR2.1.4光谱测试溶液的制备PBS（磷酸盐缓冲液）溶液（0.01mol/L，pH=7.4）的制备：①先配制0.2mol/LNa2HPO4，称量71.64gNa2HPO4•12H2O加蒸馏水至1000ml；②再配制0.2mol/LNaH2PO4,称量35.6gNaH2PO4•2H2O加蒸馏水至1000ml；③按取81.0ml①溶液+19.0ml②溶液的比例，再加入17.0gNaCl和1800ml蒸馏水，用NaOH或HCl调节pH至7.4后再加入蒸馏水补足至2000ml。荧光探针L3的配制：用色谱纯DMSO溶解荧光探针L3并且定容得到1mmol/L的探针母液，然后取3μl探针母液加入到3ml比色皿中，用3mlPBS（磷酸盐缓冲液）溶液（0.01mol/L，pH=7.4）稀释到1μmol/L作为荧光探针L3溶液。过氧亚硝基阴离子（ONOO-）溶液的配制：根据文献方法合成，用0.1mol/L氢氧化钠水溶液稀释，通过紫外吸收光谱测定302nm的吸光度值，依据朗伯-比尔定律计算过氧亚硝酸根的浓度，ε=1670M-1cm-1。2.2结果与讨论2.2.1探针L3对0NOO-的荧光响应研究为了研究探针L3对0NOO-的荧光响应，我们用紫外-可见光分光光度计对探针L3进行了紫外-可见光吸收光谱的测定。图2.2探针L3与ONOO-反应前后的紫外-可见吸收光谱图如图2.2所示，通过对比可以发现，探针L3（10μM）本身在紫外-可见光吸收光谱中300nm左