荧光素酶实验-第二篇

双荧光素酶报告基因检测（二）双荧光素酶实验通常被用来评估miRNA是否与其潜在的靶基因发生相互作用。实验中，预测的miRNA靶标基因的3’-UTR序列被克隆到含有萤火虫荧光素酶的报告基因载体的3’-UTR位置。如果miRNA与插入到质粒中的目标序列发生结合，miRNA将通过抑制该序列的翻译来降低萤火虫荧光素酶的表达，进而导致荧光强度的下降。这一变化可以作为miRNA与靶基因结合的指标。miRNA简介microRNA（miRNA）是一类长度在22nt左右的小RNA分子，它并不编码蛋白质，因此miRNA与siRNA和circRNA等小RNA分子一样，也是一种非编码RNA。通过参与调节其下游基因翻译过程面发挥其生物学功能。miRNA的功能机制与siRNA相似，主要通过与靶RNA的碱基形成互补配对，从而导致RNA诱导的沉默复合体（RISC）介导的RNA降解或阻止mRNA被翻译成蛋白。区别在于，miRNA通常与mRNA的3'UTR区域发生结合。miRNA与靶基因的作用机制通过将miRNA靶基因的结合位点构建到荧光素酶报告载体系统里，同时和miRNA寡核苷酸转染，观察荧光的强度变化，来判断miRNA是否作用了靶基因。miRNA的基本作用机制有两种：1.抑制蛋白翻译miRNA能以4种不同的方式抑制蛋白质表达：(1)使正在翻译的蛋白发生降解；(2)抑制翻译延伸；(3)使翻译过早终止（使核糖体从RNA上提早掉下来，没法行使翻译功能）；(4)抑制翻译起始。2.通过不完全的miRNA-mRNA互补配对诱导靶RNA降解。由于miRNA的作用机制是比较复杂的，所以我们在检测miRNA作用的时候，不光要检测一下它的靶基因的RNA水平的表达，还要检测一下靶基因的蛋白表达。图1载体构造与miRNA与靶基因的作用机制(DOI：10.3892/or.2018.6944)miRNA与靶基因的作用实验步骤通过实验原理我们知道对于miRNA靶基因验证实验我们需要构建的转染工具有：（1）对于miRNA有miRNA对照组（miRNA-NC）和miRNA过表达（miRNA）；（2）对于靶基因的3’UTR有3’UTR空载对照组（3’UTR-NC），3’UTR野生型（3’UTR-WT），3’UTR突变型（3’UTR-Mut）。一般是按照如下分为六组（已用序号标明）。1.microRNA靶点的预测利用Targetscan,miRDB,PicTar软件预测靶基因3’UTR与microRNA的结合位点。2.构建含靶基因3’UTR的双荧光素酶报告基因载体根据软件预测的靶基因3’UTR与microRNA的结合位点，设计引物PCR扩增靶基因3’UTR序列，或直接进行基因合成，再插入到双荧光素酶报告基因载体上。3.microRNAmimics和microRNAnegativecontrol的合成合成相应的microRNAmimics和microRNAnegativecontrol.4.细胞转染准备将靶基因3’UTR的双荧光素酶报告基因载体和microRNAmimics或microRNAnegativecontrol共转染293T或Hela细胞。5.荧光素酶检测共转染细胞24-72h后，进行双荧光素酶检测，确定目的microRNA的靶基因。卡梅德生物（KMDBioscience）(/)建立了完善的细胞培养平台，能够提供给客户多种细胞学基础实验，可以提供优质的免疫检测服务—双荧光素酶标记基因检测。我们从以下案例来分析：案例我们以MicroRNA-1269binhibitsgastriccancerdevelopmentthroughregulatingmethyltransferase-like3(METTL3)来分析。MicroRNA（miRNA）表达失调与许多肿瘤的进展有关，据报道，miR-1269b的异常表达在某些癌症的进展中起着关键作用，研究旨在研究miR-1269b在胃癌（GC）进展中的作用及其隐藏机制。METTL3是GC细胞中miR-1269b的下游靶标，通过StarBase在线分析数据库(/)，发现miR-1269b和METTL3mRNA3-UTR之间存在结合位点（图3A）双荧光素酶报告分析强调miR-1269b过表达可以降低293T细胞中METTL3-WT的萤光素酶活性，但METTL3-MUT的表达没有受到显著影响，qRT-PCR和Western印迹表明，与对照（miR-NC或miR-in）相比，miR-1269b过表达显著降低了NCI-N87细胞中METTL3mRNA和蛋白质的表达，而miR-1269b抑制剂转染SNU-16细胞的作用相反（图3C和D）。通过qRT-PCR，我们还发现METTL3在GC组织中的表达明显高于邻近组织（图3E）。相关性分析强调，miR-1269b的表达与GC组织中METTL3mRNA的表达呈负相关（图3F）。上述结果表明，miR1269b可以靶向METTL3mRNA3-UTR，并负调控GC细胞中METTL3的表达。Fig.1METTL3isthetargetofmiR-1269bA)ThepredictedbindingsequencebetweenMETTL3mRNA3UTRandmiR-1269b.(b)Dual-luciferasereportergeneassaywasusedtoverifythebindingrelationshipbetweenMETLL3mRNA3UTRandmiR-1269b.(c)and(d)qRT-PCRandWesternblotwereusedtodetecttheexpressionofMETTL3mRNAandproteininNCI-N87andSNU-16cellstransfectedwithmiR-1269bmimicsorinhibitors.(e)qRT-PCRwasusedtodetecttheexpressionofMETTL3mRNAinGCtissuesandadjacenttissues.(f)PearsoncorrelationwasusedtoanalyzethecorrelationbetweenMETTL3mRNAexpressionandmiR-1269bexpressioninGCtissues.**P<0.01,and***P<0.0这张图片主要内容为验证miR-1269b和靶基因METTL3互作。图a：StarBase进行生物信息学分析靶基因的3’-UTR区序列是否有miRNA结合位点；图b：双荧光素酶报告基因实验；图c和d：qRT-PCR和WB检测miR-1269b对靶基因METTL3mRNA和蛋白表达水平的影响；图f：相关性分析miRNA-1269b和靶基因METTL3之间的关系。接着，我们又对以下的文献进行分析，Hepatocyte-specificsuppressionofmicroRNA-221-3pmitigatesliverfibrosis，主要为miR-221-3p结合Gnai基因3’UTR区调节HSCs细胞活化影响肝纤维化。miR-221-3p通过GNAI2抑制了HSCs的激活，慢性肝损伤期间，阻断肝细胞中的miRNA-221-3p功能有助于肝脏的恢复和更快地解决细胞外基质的沉积问题。此外，作者证明，miRNA-221-3p对GNAI2具有转录后调控作用，导致C–Cmotif趋化因子配体2的分泌减少，从而减轻了肝纤维化。miRNA-221-3p的抑制可作为治疗肝纤维化的治疗方法之一。通过生物信息学分析以及相关软件预测，获得miR-221-3p可能的靶向基因Gnai2（A）。WB和qPCR结果显示，与健康组相比GNAI2的表达水平较低（B)，与Control相比，AAVTud组GNAI2表达水平提高（C，D），这可能与miR-221-3p的上调有关。之后用miR-221-3pmimics处理正常肝细胞，结果显示，与阴性对照组相比，miR-221-3pmimics处理组的GNAI2表达水平显著降低（E）。双荧光素酶实验结果进一步证明了miR-221-3pmimics直接靶向Gnai2的3’UTR。综上，作者证明miR-221-3p直接参与Gnai2的转录后调控。Fig.1Gnai2isanoveltargetgeneofmiR-221-3p.(A)A30UTRsequenceofGnai2targetedbymiR-221-3p.(B)GNAI2issignificantlydownregulatedinprimaryhepatocytesisolatedfromfibroticlivertissuesinvivo.AAVTuDinjectionleadstoupregulationofGnai2(C)mRNAand(D)proteinlevelsinisolatedprimaryhepatocytes(n=7mice/group).(E)TransfectionofmiR-221-3pmimicinprimaryhepatocytesleadstoadecreaseinGNAI2proteinlevelscomparedwithrespectivescramblecontrol(n=5).(F)DualluciferasereporterassayshowsthatmiR-221-3pdirectlybindsto30UTRofGnai2,suggestingthatGnai2isadirecttargetofmiR-221-3p.Dataareshownasfoldchangeandcomparedwiththecontrolgroupsetas1.Errorbarsrepresent±SEM.One-wayANOVAwasusedforstatistic