猪流行性腹泻诊断技术

1猪流行性腹泻诊断技术本标准规定了猪流行性腹泻(PED)的病毒分离鉴定与检测病毒抗原的直接免疫荧光法、双抗体夹磷酸盐缓冲液(PBS)、细胞培养液、病毒培养液及N-2-羟乙基哌嗪-N’-2-乙烷磺酸(HEPES)液(配制方法见附录A)。将采集的小段空肠连同肠内容物用含1000IU/mL青霉素、1000μg/mL链霉素、PBS液制成5倍悬液，在4℃条件下3000r/min离心30min,取上清液，经0.22μm微孔滤膜过滤，分装，-20℃保存将过滤液(病毒培养液的10%)接种于Vero细胞单层上，同时加过滤液量50%的病毒培养液，37℃吸附1h,根据组织培养瓶大小添加病毒培养液至病毒培养总量，置37℃培养，逐日观察3d～4d,按致细胞病变作用(CPE)变化情况，可盲传2代～3代。2采急性期内(5d～7d)患猪空肠中段的粘膜上皮做涂片或肠段做冷冻切片(4μm～7μm),丙酮中固定10min,置PBS中浸泡10min～1将分离毒细胞培养24h～48h的盖玻片及阳性、阴性对照片在PBS中冲洗数次，放入丙酮中固定10min,再置于PBS中浸泡10min～15min,风干。3.2.2.1用0.02%伊文思蓝溶液将FA稀释至工作浓度(1:8以上合格)。3.2.2.24000r/min离心10min,取上清液滴于标本上。3.2.2.337℃恒温恒湿染色30min,用PBS冲洗3次，依次为3min、4min、5min,风干，滴加磷酸盐a)++++:呈闪亮苹果绿色荧光；4.1.2猪抗PED-IgG及猪抗PED-IgG-HRP(HRP4.1.4待检样品：发病仔猪粪便或肠内容物，用浓盐水1:5稀释，3000r/min离心20min,取上清液每次3min:原、阳性抗原及稀释液对照各两孔。置37℃作用2h,弃样品，冲洗同4.2.2。每孔加100μL经酶标抗体稀释液稀释至使用浓度的猪抗PED-IgG-HRP,置37℃2h,弃液，冲洗34.2.5加底物溶液每孔加新配制的底物溶液100μL,置37℃30min。4.2.6终止反应4.3结果判定用酶标测试仪在波长492nm下测定吸光度(OD)值。阳性抗原对照两孔平均OD值>0.8,阴性抗原对照两孔平均OD值≤0.2为正常反应，按以下两个条件判定结果：P/N值≥2,且被检抗原两孔平均OD值≥0.2判为阳性，否则为阴性。5血清中和试验5.1材料准备5.1.1器材：微量移液器及配套吸头，96孔微量平底反应板，二氧化碳培养箱或温箱，倒置显微镜，微量振荡器及小培养瓶等。5.1.3病毒抗原和标准阴、阳性血清。5.1.4指示毒毒价测定后立即小量分装，一30℃冻存，避免反复冻融，使用剂量为500TCIDso～10005.1.5样品：同头份的健康(或病初)血清和康复三周后的双份被检血清在同条件下测定，单份血清也可以进行检测。5.2操作方法5.2.2经微量振荡器振荡1min～2min,置37℃中和1h。5.2.3每孔加细胞悬液100μL(20万～30万个细胞/mL),微量板置37℃二氧化碳培养箱或用胶带封口置37℃温箱培养，72h～96h判定结果。5.2.4设阴、阳性对照，病毒对照和细胞对照，阴性血清与待检血清同倍稀释，阳性血清做2-°稀释。5.3结果判定当病毒抗原及阴性血清对照组均出现CPE,阳性血清及细胞对照组均无CPE时，试验成立。以能抑制50%以上细胞出现CPE的血清最高稀释度的倒数判定为该血清PED抗体效价的滴度。血清中和抗体效价1:8以上为阳性反应；1:4为疑似反应；小于1:4为阴性反应，疑似血清复检发病后三周以上的康复血清滴度是健康(或病初)血清滴度的4倍或以上判为阳性反应。6.1材料准备6.1.1仪器设备：定量加液器，微量移液器及配套吸头，96孔或40孔聚乙烯微量反应板，酶标测试仪等。6.1.2抗原和酶标抗体。4洗液冲洗3次，每次3min。将每份被检血清样品用血清稀释液做1:100稀释，加入两个孔，每孔100μL。每块反应板设阳性、阴性血清及稀释液对照各两孔，每孔100μL盖好包被板置37℃湿盒内1h,冲洗同6.2.2。用酶标抗体稀释液将酶标抗体稀释至使用浓度，每孔加100μL,置37℃湿盒内1h,冲洗同6.2.2。6.2.5加底物溶液照血清的两孔平均OD值≤0.162为正常反应，OD值≥0.200为阳性；OD值0.200～0.400时判为“+’;0.400～0.800判为“++”;OD值>0.800判为“+++”;OD值在0.163～0.200之间为疑似；OD值<0.163为“-”,对疑似样品可复检一次，复检结果如仍为疑似范围，则看≥2判为阳性，P/N比值<2者判为阴性。5(规范性附录)A.10.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(PBS)的配制A.1.10.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取磷酸氢二钠(Na₂HPO₄·12H₂O)71.64g,先加适量无离子水溶解，最后定容至1000mL,混匀。A.1.20.2mol/L磷酸二氢钠溶液：称取磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·2H₂O)31.21g,先加适量无离子水溶解，最后定容至1000mL,混匀。A.1.3量取0.2mL/L磷酸氢二钠溶液360mL,0.2mol/L磷酸二氢钠溶液140mL,称取氯化钠38g,用无离子水溶解稀释至5000mL,4℃保存。A.2细胞培养液的配制含10%灭活犊牛血清的1640营养液，加100IU/mL青霉素、100pg/mL链霉素，用5.6%碳酸氢钠(NaHCO₃)调pH值至7.2,如需换液则血清含量为5%。A.3病毒培养液的配制1640培养液中加下列成分使最终浓度各达到：1%二甲基亚枫(DMSO);以5.6%碳酸氢钠(NaHCO₃)调pH至7.2。A.4HEPES液的配制称取0.2385gHEPES溶于100mL无离子水中，用1mol/L氢氧化钠(NaOH)调整pH至7.0~7.2,过滤后置4℃备用。(规范性附录)直接荧光抗体法溶液的配制B.10.1%伊文斯蓝原液的配制称取伊文斯蓝0.1g溶于100mL0.02mol/L浓度。B.2磷酸盐缓冲甘油的配制量取丙三醇90mL,0.02mol/LpH7.2PBS10pH7.2PBS中，4℃保存，使用时稀释成0.02%mL,振荡混合均匀即成，4℃保存。6(规范性附录)双抗体夹心ELISA溶液的配制C.1洗液的配制量取50μL吐温-20,加入100mL0.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液(见第A.1章)中。C.2包被稀释液的配制C.2.10.1mol/LpH9.5碳酸盐缓冲液：0.1mol/L碳酸钠液：称取碳酸钠10.6g,加无离子水至1000mL。0.1mol/L碳酸氢钠液：称取碳酸氢钠8.4g,加无离子水至1000mL。C.2.2量取0.1mol/L碳酸钠液200mL,0.1mol/L碳酸氢钠液700mL,混合即成。C.3样品稀释液的配制加0.05%吐温-20,1%明胶的0.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液。C.4酶标抗体稀释液的配制加0.05%吐温-20,1%明胶及5%灭活犊牛血清的0.02mol/LpH7.2磷酸盐缓冲液。C.5底物溶液的配制pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液(内含0.04%邻苯二胺及0.045%过氧化氢)。pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液：称取柠檬酸21.01g,加无离子水至1000mL,量取243mL与0.2mol/L磷酸氢二钠液(见A