基因工程实验

本实验课程以一个基因片段的获得,表达和纯化和活性分析为主线,抓住蛋白和核酸两大主题,建立一个综合型和研究性的大实验教学体系,重视各项技术的衔接,启迪学生的科学思维和创新意识,提高学生对实验方法和实验技术的综合运用能力课程设计的思路：实验一、E.coli染色体DNA提取实验原理：①溶菌酶破壁②蛋白酶K水解③菌体核蛋白变性④染色体DNA沉淀〔氯仿可使蛋白变性并有助于液相与有机相的别离〕实验步骤：1.收集菌体:1ml菌液/2人,5k,5,弃上清。2.加0.5mlBufferA,振荡混匀。3.加50l10%SDS至终浓度1%,混匀。4.加5lProK至终浓度0.1mg/ml,55℃保温1h。5.加等体积PCI,混匀,12k,5。6.加等体积氯仿,12k,57.加0.8V异丙醇,冰浴30,12k,5。8.70%Eth洗涤沉淀,12k,5。9.枯燥后溶于20lTE,20℃保存考前须知：①Tris-饱和酚的使用②防止剧烈振荡③EP管的使用〔酚与氯仿是非极性分子,水是极性分子,当蛋白水溶液与酚-氯仿混合时,蛋白分子之间的水分子就被酚-氯仿挤去,使蛋白失去水合状态而变性.经过离心,变性蛋白的密度比水的密度大,因而与水相别离,沉淀在水相下面,从而与溶解在水相中的DNA分开.而酚-氯仿有机溶剂比重更大,保存在最下层.作为外表变性的酚与氯仿,在去除蛋白的作用中各有利弊,酚的变性作用大,但酚与水相有一定程度的互溶,大约10-15%的水溶解在酚相中,因而损失了这局部水相中的DNA,而氯仿的变性作用不如酚效果好,但氯仿与水不相混溶,,不会带走DNA.所以在抽提过程中,混合使用酚与氯仿效果最好.经酚第一次抽提后的水相中有残留的酚,由于酚与氯仿是互溶的,可用氯仿第二次变性蛋白,此时一起将酚带走〕实验二：紫外吸收检测DNA的浓度与纯度实验原理：苯环结构AbsorT%光谱扫描定量测定〔TU-1901双光束紫外可见分光光度计;DNA或RNA链上碱基的苯环结构在紫光区具有较强吸收,其吸收峰在260nm处,吸收低谷在230nm;在260nm时,DNA或RNA的光密度OD260不仅与总含量有关,也随构型而有差异.对标准样品来说,浓度为1g/ml时,DNA钠盐的OD260＝0.02,当OD260＝1时,dsDNA浓度约为50g/ml,ssDNA浓度约为33g/ml,RNA浓度约为40g/ml,寡核苷酸浓度约为30g/ml(由于底物不同有差异);紫外分光光度计只用于测定浓度大于0.25g/ml的核酸溶液〕DNA浓度的估算：dsDNA(g/ml)=50(OD260)倍数ssDNA(g/ml)=33(OD260)倍数泰山虫草的核基因组DNA紫外吸收扫描图RNA浓度的估算：RNA(g/ml)=40(OD260)倍数酵母RNA(50g/ml)的扫描图谱核酸纯度的判断DNA:A260/A280=1.8,＞1.8RNA:A260/A280=2.0残留酚、蛋白凝胶电泳〔假设为DNA样品,A260/A280比值大于1.8,说明存在RNA,可以考虑用RNaseA处理;小于1.6,说明样品中存在蛋白质或酚,应再用酚-氯仿抽提,以乙醇沉淀纯化DNA.RNA样品A260/A280比值小于2,应考虑再用酚-氯仿抽提〕实验步骤：①TEbuffer稀释:50、100②旋涡振荡,混匀,离心③预热15min④CK:400lTE,校零⑤样品测试,A260、A280实验四：目的DNA片段的回收实验原理：电荷效应分子筛效应硅胶膜吸附〔凝胶是支持电泳的介质,它具有分子筛效应.核酸是一种两性电解质,在pH8.0-8.3时带负电荷,电泳时向正极移动;而在pH3.5时带正电荷.凝胶回收试剂盒提纯DNA片段的原理:主要是通过吸附材料的DNA结合法来到达DNA别离、纯化的目的.吸附材料包括硅基质材料、阴离子交换树脂与磁珠等.其中硅基质材料在高盐低pH(pH＜7.5)时高效、专一地吸附DNA或RNA,在低盐高pH(pH＞7.8)条件下洗脱,可以回收100bp以上的片段,效率达70%以上。在电场和介质中,不同长度或不同构型的DNA呈现不同的Rf,根据别离片段在凝胶中的位置并参考Marker确定其大小DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电荷,在电场中向正极移动.用电泳法测定DNA分子大小时,应尽量减少电荷效应凝胶回收kit提纯原理:①MB打断H键;蛋白解离②MW洗去剩余胶液及杂质③EB洗脱吸附DNA目的基因的回收包括两个过程:〔首先是凝胶中的DNA吸附到柱子中的硅胶粒上,主要靠缓冲液调节吸附柱与DNA的pH,来促进DNA吸附到柱子上,离心后将胶液去掉;其次,将吸附到柱子上的DNA重新返溶解到洗脱缓冲液中,再通过离心收集到新的EP管中,到达纯化基因的目的.〕①膜结合液(溶胶buffer)中的高氯酸钠(NaClO4)又称过氯酸钠,能打断琼脂糖聚合物中糖基间的氢键,使琼脂糖胶块溶解,而且高盐浓度也使与DNA结合的蛋白解离下来;②膜漂洗液(MW)的主要作用是洗去剩余的琼脂糖溶液与杂质,MW除含有缓冲系统外,还有一定浓度的乙醇,用于洗去高盐等杂质,也易使含DNA的硅胶颗粒枯燥;③洗脱缓冲液(EB)的作用是使吸附的DNA重新溶解到缓冲液中切胶回收DNA片段电泳图实验步骤：1.PCR产物的凝胶电泳①0.4gAga→40mlTAE,煮沸②冷却至55℃,2lEtBr③倒胶,插梳子,凝固30min④加TAE,浸过胶面⑤点样:2l上样液+样品;marker⑥80V电泳,观察；2.切胶与溶胶①称EP管,算胶重1mg胶加1lMB②UV302nm下切胶〔55℃水浴,隔2摇匀〕MB:膜结合液(membranebinding)实际上是一种溶胶缓冲液；3.DNA结合①切胶→1.5mlEP管②加MB,55℃溶胶③胶液→吸附柱→收集管④12000g,离心1；4.清洗与洗脱⑤600lMW→吸附柱⑥12000g,离心30s⑦重复⑤⑥;离心2⑧加25lEB⑨12000g,离心1考前须知1.平安性:EB,UV2.Aga彻底熔化3.垂直上拔梳子4.忌点样孔穿透5.尽量低电压6.长波切胶7.胶块尽量小8.凝胶全熔实验五：目的DNA片段与载体的连接实验原理：PCR产物3T载体3实验步骤：5l连接反响体系反响体系①②PCR回收产物2.0l

ddH2O

1.5lpMD18-T0.5l0.5l对照DNA

0.5l2连接液I2.5l2.5l低速离心,16℃连接1h,用于转化〔PCR产物与T载体连接前最好进行纯化,以减少引物及其它杂质对连接的影响;纯化方法可以采用PCR产物纯化试剂盒盖紧盖子用手指轻弹EP管或用微量进样器混匀反响液,于台式离心机转2秒钟,以集中样品〕实验六：E.coli感受态细胞的制备与转化实验原理：①Ca2+:细胞膨胀,膜磷脂,液晶②Ca2+与DNA→羟基-磷酸钙③42℃热激:膜通透性〔①将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中,使细胞膨胀,同时Ca2+使细胞膜磷脂层形成液晶结构,使得位于外膜与内膜间隙中的局部核酸酶离开所在区域,这就构成了E.coli人工诱导的感受态;②此时参加DNA,Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物,并粘附在细菌细胞膜的外外表上;③经短暂的42℃热脉冲处理后,细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动,随之出现许多间隙,致使通透性增加,DNA分子便趁机进入细胞内〕实验步骤：1.感受态制备：①过夜菌,12%种量扩大②振荡23h,OD600=0.4,预冷③菌液1ml/组,3k,4℃离心5④0.3ml预冷CaCl2轻匀⑤离心,0.1mlCaCl2悬浮沉淀；2.筛选平板的制备：①LB固体M熔化,至60℃加Ap(100g/ml),倒平板,20ml/皿②40lX-gal&4lIPTG/皿,涂布③放置10min；3.重组质粒转化：①5l连接液+50l感受态,轻匀,冰浴30②CK:50l感受态③42℃水浴热激2④冰浴2,加450lLB(摇匀),37℃,1h⑤离心5,100lLB悬浮沉淀转化反响：No转化类型ddH2O受体菌CK+目的片段T-vol1CK+4.5ml50ml0.5ml055ml2CK5.0ml50ml0055ml3转化组050ml05ml55ml4.铺平板：①55lCK+、CK、转化组涂布LB固体M(含0.1mg/mlAp〕②平板放置10min③37℃倒置,1624h④观察结果实验七：碱变性质粒DNA的提取实验原理：①细胞裂解②质粒别离③乙醇沉淀〔溶菌酶是糖苷水解酶,水解细菌细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的-1,4糖苷键,因而具有溶菌的作用.当溶液pH小于8时,溶菌酶作用受到抑制;葡萄糖的作用在于增加溶液的粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力作用而降解;EDTA的存在,有利于溶菌酶的作用,因为溶菌酶的反响要求有较低的离子强度的环境〕实验步骤：(1)2ml菌液/组,4k,3(2)100lSolⅠ,振荡1,室温5(3)200lSolⅡ,颠倒3次,冰浴5(4)150lSolⅢ,同上(5)12k,离心8,转上清(6)等体积PCI,混匀,12k,5,转上清(7)加Vol3MNaAc(pH5.2),2Volalc(8)20℃放置30,12k,离心10(9)0.3ml预冷70%Eth洗沉淀,12k,5(10)枯燥后溶于20lTE,20℃保存考前须知：①摇菌时施加选择压②收集菌体时尽量除尽水分③加溶液Ⅱ5后,是否变粘稠?④SDS质量影响产率〔加溶液II5min后,没有看到溶液变粘稠时,实验不能继续做下去.要检查所用试剂是否正确?数量是否符合;对SDS的要求较高,使用重结晶的分析纯SDS,质粒得率较高〕实验八：重组质粒的酶切鉴定实验原理：BamHI单切BamHI单切实验步骤：1.酶切反响步骤：ddH2O于EP管→10buffer→质粒DNA→限制酶→混匀,离心5s→37℃,50→65℃水浴10〔1〕单酶切反响成分ddH2O10KBufferDNABamHITotal需量(l)7.52100.520BamHI(15U/l)组/4人;30℃,50成分ddH2O10HBufferDNAEcoRIPstI需量(l)7.52100.250.25(2)双酶切反响EcoRI&PstI(15U/l)组/4人;37℃,502.凝胶电泳检测:①0.8%Aga,30mlTAE,煮沸②冷却至55℃,2lEtBr③倒胶,插梳子,凝固20④2l上样液+样品⑤100V电泳,观察(配制0.8%琼脂糖凝胶(30ml),加20lEB,酶切样品全部点样,另外取10l未酶切质粒作对照,100V电泳,待溴酚蓝移至胶的3/4位置结束电泳;-HindIIIdigestDNAmarker(50ng/l),由于cos末端之间的结合,会影响23k和4.36k的条带,因此,电泳前热处理(60℃,5min),使Marker的电泳图像变得更为清晰)酶切失败的可能原因:①不全切或根本未切②缓冲体系不适宜③酶量过多④样品杂质含量高DNA被降解：痕量DNase(酶切失败主要表现为两方面:(1)不完全酶切甚至是DNA根本未发生酶切;主要原因有:①缓冲体系不适宜,可进行重新酶切;②酶量参加过多而导致甘油抑制酶活,可将反响体系适当稀释；③DNA样品杂质含量高,可采用稀释酶切或将DNA样品重新抽提后酶切;(2)DNA被降解(不成带状):主要原因是DNA样品中含有痕量的DNA酶,建议重新抽提除去DNA酶)考前须知：①吸量要准确②最后加酶③冰上操作④勿触管盖内面⑤EP管盖严〔①吸样量一定要准确;②为了不使酶污染而导致浪费,最后才加酶;③要求在冰上操作,并充分混匀;④开启Eppendorf管时,手不要接触到管盖内面,以防污染;⑤样品在37℃与65℃保温时,将离心管盖严,以防水进入管内造成实验失败〕限制酶酶解中常见的问题和原因:(1)DNA完全没有被限制酶切割:①限制酶失活;②DNA不纯,含有SDS、有机溶剂、EDTA等;③限制酶非最正确反响条件;④酶切位点被修饰;⑤DNA上不存在该酶的识别顺序(2)DNA切割不完全:①限制酶活性下降或稀释不正确;②DNA不纯或反响条件不佳;③酶切位点被修饰;④局部DNA溶液粘在管壁上;⑤酶切后DNA黏端退火(3)DNA片段数目多于理论值:①限制酶星号活力;②存在第二种限制酶污染;③样品DNA中含有其它DNA基因工程的常规技术①别离检测②分子杂交③PCR技术④DNA测序⑤基因定点突变溜⑥DNA与Pr互作核酸的别离与检测：①gDNA的别离②质粒DNA③RNA的别离④gDNA的提取：1〕破碎2〕去蛋白⑤DNA沉淀DNA提取的三大步骤:细胞破碎、去除蛋白、去除RNA.〔液氮研磨材料,使细胞裂解,参加缓冲液螯合金属离子,以降低DNase对样品的水解;参加-巯基乙醇等抗氧化剂及PVP(聚乙烯吡咯烷酮)可降低酚类物质对DNA的干扰,PVP还可有效去除多糖〕gDNA提取方法：①浓盐法②SDS法③CTAB法高盐:溶解；低盐:沉淀；蛋白、多糖别离；NaAc-70%alc特点:去除糖类杂质;获得高质量的DNA保持CS-DNA的完整性：①物理降解②内源DNase③＞pH7DNA相对分子质量较大,机械张力或高温容易使其断裂,因此,应防止剧烈振荡和使用小口径枪头,去除尖端局部,使其口径有5mm;过酸条件,发生脱嘌呤作用,造成断裂质粒DNA的别离纯化：①拓扑学的差异②gDNA大,易解旋③质粒小,ccc状态CsCl-EB密度梯度离心:纯度高、周期长、设备要求、EB污染;碱变性:纯度较高、操作周期较短;沸水浴:纯度低、快速、操作简便质粒DNA别离的原理:gDNA大,断裂成线性分子,易解旋;质粒MW小(0.01~2%),在抽提中仍保持ccc状态1.CsCl密度梯度超离心：含EDTA的buffer悬浮菌体,加溶菌酶,CsCl和EB,超离心ON,收集cccDNA,稀释沉淀质粒结构致密,结合的EB少,密度大;gDNA结合大量EB,密度小.离心,酚去蛋白,异戊醇萃取除EB,2Eth沉淀2.碱变性法：pH12:gDNA变性彻底,cccDNA结构紧密,H键断裂,两互补链仍紧密结合;pH7:cccDNA复性快,gDNA复性慢,易聚集形成网状结构,离心后与变性蛋白及RNA沉淀,cccDNA滞留上清；SolI:50mM葡萄糖(增加溶液粘度,维持渗透压,防止DNA受机械剪切力而降解);25mMTris-HCl,10mMEDTA(螯合金属离子;溶菌酶要求低离子强度);SolII(现用现配,NaOH易潮解,与空气中的CO2形成碳酸钠):0.2MNaOH,1%SDS,去膜释放内含物;SolIII:3MNaAc(pH4.8),去gDNA及蛋白;酚-氯仿萃取,Eth沉淀;RNase水解3.沸水浴法：①加酶破壁②沸水浴40s③离心④Eth沉淀RNA的提取：提取的原理:细胞破碎、蛋白变性、乙醇沉淀.细胞破碎;异硫氰酸胍(蛋白质强变性剂)处理,使蛋白变性或降解;酸性水饱和酚(pH5.0)/氯仿抽提;乙醇沉淀利用poly(A)与其他RNA分开防止RNA降解的措施：①DEPC处理②RNasin③专用无菌台④器皿、手套、口罩⑤低温操作核酸质量检测：①紫外光谱法②凝胶电泳法③荧光分析法DNA的定量及纯度测定:①紫外光谱分析法;②琼脂糖凝胶电泳法;③荧光染料(Hoechst)测定法;④二苯胺显色法荧光(fluorescence)分光光度法:用于定量分析激素、维生素、核酸和氨基酸等生物体内的微量物质.紫外光谱法：[ssDNA]=33(A260A310)稀释[dsDNA]=50(A260A310)稀释[ssRNA]=40(A260A310)稀释凝胶电泳技术：①别离原理：分子筛:Rf→大小及构型②电荷效应：检测原理:UV→EB→荧光；；Rf、分辨力的影响因素：①大小,构型②gel浓度③电压、时间④buffer凝胶浓度的影响:低浓度胶:分子量大→清楚,分子量小→smear;高浓度胶:小→狭带,大→不清缓冲液及其pH；①TBE:缓冲力大②长:TAE﹥TBE③短:TAE分辨力低RNA的检测：①A260②变性胶③28S→4.5kb④18S→2.1kbPAGE①尿素buffer:0.51TBE,②同位素或荧光标记：测序、多态性分析分子杂交技术：①Southernblot②Northernblot③Westernblot④dotblot⑤FISH⑥菌落原位杂交探针与探针标记：①寡核苷酸片段②ssords③足够长度④不含互补区1.探针的标记：5‘…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3‘…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’↓DNaseI5’…G-C-T-CA-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’DNApolIMg2+↓5dNTP5pppdA(-32P-dATP5’…G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T…3’3’…C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A…5’使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程,同位素或非同位素.化学合成;cDNA合成;mRNA;PCR扩增标记.探针标记的方法:缺口平移、随机引物、5末端标记.2.标记物及其检测：放射性标记非放射性标记物及性质标记方法杂交体检测法地高辛:DIGRPL酶标抗体-底物显色生物素:Bio-16-dUTPNT,TL,PCR酶标亲合素显色荧光素:罗丹明,FITC合成法荧光显微镜RPL:随机引物标记.FITC:异硫氰酸荧光素,通过荧光显微镜或免疫组织化学检测生物素标记：生物素又称维生素H，也是一种小分子的半抗原，存在于蛋黄中.抗生物素蛋白(avidin),又称亲合素，一种糖蛋白荧光素标记：荧光素是一类在激发光作用下发射出荧光的物质,通过荧光显微镜或免疫组织化学检测Southern杂交：质粒鉴定、基因位置、分子诊断Southern:DNA的分子鉴定.酶切和电泳法:重组克隆的初步鉴定Northern杂交：①样品,电泳,探针②不宜碱变性③勿低盐buffer洗膜④胶中无EBWestern杂交：电泳,印迹,免疫学。。步骤：①SDS,blot②杂交(AP或HRP)电泳:SDS;探针:抗体;抗体与靶蛋白特异性反响.FISH杂交：①制片②探针制备③杂交④镜检、拍照菌落(斑)原位杂交：以菌落(噬菌斑)为对象检测重组子的技术;依重组质粒(phage)的靶序列,合成与之互补的DNA片段,作杂交探针.用途:从未知重组子检测与探针序列互补的阳性重组子PCR扩增技术：①链式反响②动物单拷贝G；根本原理：①离体合成②几何级数③平台效应反响体系：模板引物Taq酶dNTPs缓冲液引物的设计：①1630nt,GC含量②连续互补碱基﹤3③3׳正确配对④5׳可被修饰⑤简并引物耐热的DNApol：Taq酶Pfu酶3→5校读高保真缓冲液：①pH、离子强度②Mg2+↓,酶活↓③Mg2+↑,非特异↑④引物退火根本过程：变性退火延伸PCR技术的改良：①nestedPCR②inversePCR③anchoredPCR④RT-PCR⑤insituPCR⑥实时定量PCR1.巢式PCR：嵌套引物外引物内引物特点:降低错配,提高扩增特异性2.反向PCR：扩增X、Y未知序列酶R消化环化另一酶切扩增X、Y序列X、Y示未知序列;用靶序列中不存在的限制酶R消化线性DNA模板,酶切后连接成环状;另一限制酶消化环形分子,从序列切开待扩增序列未知,难以选择适当的限制酶;扩增的长度有限,＜2~3kb;扩增产物常含有重复序列;DNA分子自身环化的效率较低特点：①难选适当的限制酶②扩增的长度有限③自身环化效率低3.AnchoredPCR：锚定引物A❖PCR扩增❖产物鉴定；特点：①扩增未知序列②无需酶切及连接③操作简单④特异性高5.原位PCR：原位扩增,杂交,定量❖不需抽提模板❖灵敏度高100病毒检测、肿瘤发生率〔原位PCR:扩增组织细胞中特异核酸,原位杂交后定量分析.(1)预处理:切片常规脱蜡；0.2mol/LHCl处理10min;蛋白酶K消化;梯度酒精脱水,室温枯燥(2)原位扩增:切片滴加特异性引物,覆盖硅化盖玻片,石蜡油封边;(3)原位杂交.灵敏度比原位杂交高100〕6.实时荧光定量PCR：FRET技术;荧光标记探针荧光扩增曲线分3个阶段:①荧光背景信号阶段;②荧光信号指数扩增阶段;③平台期;实时荧光定量的原理:数学原理和化学原理几个参数确实定：①临界点②Ct③标准曲线基线→阈值→Ct值→DNA0基线是扩增曲线中的水平局部;临界点(阈值)是在荧光信号指数扩增阶段上人为设定的一个值,但一般将阈值缺省设置(default)为315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍;