DNA-RAN-琼脂糖凝胶电泳资料

核酸的提取及琼脂糖凝胶电泳

名目核酸组成理化性质核酸分别、纯化的原则核酸提取的根本步骤材料预备细胞裂解分别、纯化沉淀溶解DNA提取的常用方法RNA提取的常用方法核酸的保存琼脂糖凝胶电泳

核酸DNARNAGenomicDNA(原核、真核、病毒)细胞器DNA(叶绿体、线粒体等)质粒DNA(细菌、放线菌等)mRNA(1%-5%)rRNA(80%-85%)tRNA(小分子RNA)(15%-20%)核酸(nucleicacid)核酸的提取是分子生物学试验技术中最重要、最根本的操作。核酸的理化性质理化性质DNA化学性质稳定，物理上易碎，粘度大RNA化学性质比DNA活泼，易受RNA酶的污染溶解性

均溶于水不溶于一般有机溶剂,在70%乙醇中形成沉淀

核酸分别、纯化原则1、保持核酸分子一级构造的完整性温度不要太高把握pH值范围(pH值5-9)保持确定离子强度削减物理因素对核酸的机械剪切力核酸分别、纯化原则核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级构造。所用器械和一些试剂需高温灭菌提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂2、防止核酸的生物降解DNA酶抑制剂金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，常用EDTA(乙二胺四乙酸)离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。阴离于型外表活性剂SDS除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物有核酸酶抑制剂作用。RNA酶〔RNAase)抑制剂

DEPC(二乙基焦碳酸盐)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用留意：1.DEPC也能破坏单链核酸中大局部腺嘌呤环。2.简洁降解，保存在4℃或液氮中；3.剧毒。1：手指头2：枪头3：水/缓冲液4：试验台面5：内源Rnase6：RNA样品7：质粒抽提8：RNA保存9：阳离子(Ca,Mg)10：后续试验所用的酶Rnase污染的10大来源DNA提取的根本步骤I.材料预备II.裂解III.分别、纯化IV.沉淀或吸附核酸V.溶解材料预备使用新颖材料，样品材料不要反复冻融提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞〔白细胞〕含病毒的液体材料DNA含量较少，提取前先富集基因组DNA的提取细胞裂解

裂解液经典的裂解液几乎都含有去污剂和盐，可以抑制样品中的核酸酶含蛋白酶的裂解方法：基因组DNA高浓度蛋白变性剂的裂解方法：RNA含CTAB的裂解法：富含多糖的样品的基因组DNA含SDS碱裂解法：质粒DNA核酸分别、纯化蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性〔SDS、异硫氰酸胍等〕高盐洗涤核酸-蛋白质参与NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；蛋白酶处理核酸分别、纯化多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中参与1/2体积的5MNaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加确定量的氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。核酸沉淀、溶解重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。乙醇优点：对盐类沉淀少，沉淀中所含乙醇易挥发除去，不影响以后试验。缺点：需要量大，一般要求低温操作。异丙醇优点：需体积小，速度快，适于浓度低、体积大的DNA样品沉淀。一般不需低温。缺点：易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀．异丙醇难以挥发除去。所以，最终用70％乙醇漂洗。有机沉淀剂核酸的保存(1)对DNA①DNA样品溶于pH8.0的TE，4℃或-20℃保存；②长期保存样品中可参与1滴氯仿。(2)对RNA①RNA样品溶于0.3mol/LNaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70℃保存;②长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;DNA提取的常用方法

基因组DNA的提取

SDS法其它原理基因组DNA－SDS法SDS在高温〔55～65℃〕条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。组份Tris-HCl（pH8.0）EDTA（pH8.0）NaClSDS终浓度100mM20mM1.4M2%(W/V)SDS提取缓冲液的配方Tris-HCl〔pH8.0〕供给一个缓冲环境，防止核酸被破坏；EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；NaCl供给一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；SDS裂解细胞，使蛋白变性，染色体离析；吸附材料结合法：依据核酸分别纯化方式的不同有：高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的试验。磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而到达分别目的。其他方法硅质材料阴离子交换树脂磁珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的试验。阴离子交换树脂磁珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的试验。阴离子交换树脂磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而到达分别目的。磁珠低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的试验。阴离子交换树脂磁珠硅质材料高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。硅质材料低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的试验。阴离子交换树脂高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。快捷高效。硅质材料阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的试验。阴离子交换树脂阴离子交换树脂低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。适用于纯度要求高的试验。阴离子交换树脂磁珠磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的物，从而到达分别目的。磁珠Trizol是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂，内含异硫氰酸胍，酚等物质，异硫氰酸胍能快速溶解蛋白质，导致细胞构造裂开。核酸由于核蛋白二级构造的破坏而解离下来。异硫氰酸胍同时抑制细胞释放出的核酸酶，保持RNA的完整性。TRIZOL法提RNA目前有不少商业化的核酸抽提试剂盒可供选用，具体操作步骤参考各种产品说明书。问题一：DNA降解材料不新颖、反复冻融或细胞年轻提取操作过于猛烈，DNA被打断外源核酸酶污染低温保存，避开反复冻融液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前参与裂解缓冲液增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后操作应尽量轻柔试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌DNA分装保存于缓冲液，避开反复冻融核酸提取常见的问题问题二：DNA样品不纯DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反响DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤的次数〔2-3次〕试验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丧失尽量选用新颖〔幼嫩〕的材料动植物要匀浆研磨充分，裂解时间适当延长〔对于动物细胞、细菌可增加PK的用量〕低温沉淀，延长沉淀时间加帮助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少RNA提取常见问题一：样品不纯

蛋白多糖多酚DNA离子保证彻底的裂解和确定转数确定时间的离心增加有机溶剂抽提的次数，用吸附柱纯化参与不含RNase的DNase处理增加洗涤次数RNA提取常见问题二：得率低

样品太多或太少RNA在柱子上未洗出洗出液中有酒精削减或增加样品使用量参与RNaseFree,放置几分钟再离心漂洗后再次离心RNA提取常见问题三：降解

样品不新颖或保存不当RNase污染RNA溶液储存不当取新颖的样品；取样后立刻放入液氮或储存液保存研磨样品准时补充液氮严格处理相应的器具和试剂-70℃冻存，分装使用为了检测提取核酸的浓度和内参，需要连续做琼脂糖凝胶电泳试验试验原理〔1〕DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。分子质量越小跑得越快，严密构型快于松散型开环分子或线性分子，从而可以分别大小不同的DNA或RNA分子。〔2〕琼脂糖是一种线性多糖聚合物，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小准备于琼脂糖的浓度。浓度越高，孔隙越小，其区分力气就越强。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶缓冲液〔1〕制备凝胶和胶板：100ml(1×TBE)+1g琼脂糖〔三角瓶〕，煮胶，溶解，冷却至60℃(不烫手)，加EB替代物，倒板(4-6mm)，室温下充分凝固，竖直拔下梳子。〔2〕加样：5μl质粒DNA+1μlloadingbuffer，混匀5μlPCR产物+1μlloadingbuffer，混匀〔3〕电泳：电压80-120V，留意电极方向15min〔4〕观看：紫外透射下观看。电泳常见问题分析DNA降解：避开核酸酶污染。电泳缓冲液陈旧：电泳缓冲液屡次用后，离子强度降低，pH值上升，缓冲力气减弱，从而影响电泳效果。建议常常更换电泳缓冲液。DNA变性：电泳前勿加热，可以在电泳仪上面放冰袋，避开温度高变性条带浅，Marker弥散了---那要么就是胶的问题，要不就是buffer的问题。