实验二 双水相萃取分离糖化酶

实验双水相萃取分离糖化酶糖化酶

糖化酶，又称葡萄糖淀粉酶，它能把淀粉从非还原性未端水解a-1.4葡萄糖苷键产生葡萄糖，也能缓慢水解a-1.6葡萄糖苷键，转化为葡萄糖。同时也能水解糊精，糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。

糖化酶用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素、有机酸、氨基酸、维生素的发酵；本品还大量用于生产各种规格的葡萄糖。总之，凡对淀粉、糊精必需进行酶水解的工业上，都可适用。双水相体系就是考虑到这种现状，基于液液萃取理论同时考虑保持生物活性所开发的一种新型的液液萃取分离技术。双水相萃取1概述双水相萃取技术的优点：作为一种新型的分离技术，克服了常规萃取有机溶剂对生物物质的变性作用，提供了一个温和的活性环境，在萃取过程中具有保持生物物质的活性及构象等明显的技术优势。双水相萃取技术缺点：易乳化、相分离时间长，成相聚合物的成本较高，水溶性高聚物大多数黏度较大，不易定量控制；水溶性的高聚物难以挥发，使反萃必不可少，高聚物回收困难等。2双水相体系2.1双水相的形成机理2.1.1概念某些有机物之间或有机物与无机盐之间，在水中以适当的浓度溶解后形成互不相溶的两相或多相水相体系，两相中水的含量都很高，如下图：由聚乙二醇6000与葡聚糖两种混合物形成的双水相体系示意图：2双水相体系双水相形成的依据特征：把两种具有一定浓度的亲水性聚合物溶液混合后静置，两种高聚物分子间有斥力，某种分子希望它周围的分子是同种分子而非异种分子，这些亲水性的高分子聚合物并不混为一相，而是分成两个液相，这种现象称之为聚合物的不相容性。但对近几年开发研究的高聚物与盐、低分子量的某些表面活性剂，这样解释就显得无能为力，有待于进一步探索。2.2相图横坐标为葡聚糖的含量，纵坐标为聚乙二醇的含量，把均匀区和两相区分开的曲线称双节线，双节线下方的区域，高聚物均匀溶于水而不分相，上方的区域分为两相，上相聚集了PEG，下相是高聚物葡聚糖。2.2相图用A点代表体系总组成，B点和C点分别代表互相平衡的上相和下相组成，称为节点。A、B、C三点在一条直线上，称为系线。系线的长度是衡量两相间相对差别的尺度，系线越长，两相间的性质差别越大，反之则越小。若A向双节线移动，B、C两点接近，系线长度趋向于零时，即A点在双节线K点时，体系变成一相，K称为临界点。在同一系线上不同的点，总组成不同，而上、下两相组成相同，只是两相体积VT、VB不同。2.3常用的双水相体系常用体系

双水相萃取中常采用的双聚合物系统为PEG/Dex，该双水相的上相富含PEG，下相富含Dex。

3双水相萃取原理3.1双水相萃取的基本原理双水相萃般与水-有机相萃取的原理相似，都是依据物质在两相间的选择性分配，但萃取体系的性质不同。

当物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数。其分配规律服从Nernst分配定律

CT、CB分别代表上相、下相中的溶质的浓度。研究表明，在相体系固定时，预分离物质在相当大的浓度范围内，分配系数K为常数，与溶质的浓度无关，只取决于被分离物质本身的性质和特定的双水相体系。3.2影响物质分配平衡的因素

影响物质在双水相系统巾分配的主要因素有：组成双水相体系的高聚物类型；高聚物的平均分子量和分子量分布；高聚物的浓度；成相盐和非成相盐的种类；盐的离子强度；pH值。(1)高聚物的分子量在高聚物浓度保持不变的前提下，降低该高聚物的分子量，被分配的可溶性生物大分子如蛋白质或核酸，将更多的分配于该相。对PEG–Dcxtran体系而言，Dextran分子量减小，分配系数会减小；PEG的分于量减小，物质的分配系数会增大(见表2-13)，这是一条普遍规律。(2)高聚物浓度—界面张力的影响

当成相系统的总浓度增大时，系统远离临界点，系线长度增加，两相性质的差别(疏水性等)增大，蛋白质越容易分配到其中的一相。(3)盐类

由于盐的正、负离子在两相间的分配系数不同，两相间形成电势差，从而影响带电生物大分子的分配。如下图：加入氯化钠对卵蛋白和溶菌酶分配系数的影响研究还发现，当盐类浓度增加到一定程度，由于盐析作用蛋白质易分配于上相。分配系数几乎随盐浓度成指数增加，且不同的蛋白质增大程度各异。利用此性质可使蛋白质相互分离。KCl对分配的影响与NacI类似。(4)pH值

pH值对分配的影响源于两个方面的原因。第一，pH值会影响蛋白质分子所带电荷的性质和数量。第二，pH值影响磷酸盐的离解程度，从而改变H2PO4-和HPO42-之间的比例，进而影响相间电位差。这样蛋白质的分配因pH值的变化发生变化。pH值的微小变化会使蛋白质的分配系数政变2～3个数量级。加入的盐不同，PH值的影响也不同(5)温度

温度影响双水相系统的相图，从而影响蛋白质的分配系数。温度越高发生相分离所需的高聚物浓度越高。在临界点附近对双水相体系形成的影响更为明显。但一般来说，当双水相系统离双节线足够远时，1～2℃的温度改变不影响目标产物的萃取分离。由于高聚物对生物活性物质有稳定作用，在大规模生产中多采用常温操作，从而节省冷冻费用。但适当提高操作温度，体系黏度较低，有利于分离。3.3双水相萃取过程

双水相萃取过程包括以下几个步骤：双水相的形成；溶质在双水相中的分配；双水相的分离。3.3双水相萃取过程

在实际操作中，经常将固状(或浓缩的)聚合物和盐直接加入到细胞匀浆液中，同时进行机械搅拌使成相物质溶解，形成双水相。溶质在两相中发生物质传递，达到分配平衡。

聚合物和盐的溶解多为萃取过程的速率控制步骤。达到分配平衡后的两相分离可采用重力沉降(静置分层)或离心沉降法。3.4双水相萃取的特点

双水相萃取对于生物物质的分离和纯化表现出特有的优点和独有的技术优势，具体表现在以下方面：①易于放大。各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低。②双水相系统之间的传质和平衡过程速度快，回收效率高，能耗较小，速度快。如选择适当体系，同收率可达80％以上，提纯倍数可达2～20倍。③易于进行连续化操作，设备简单，且可直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理。④双水相体系的相间表而张力大大低于有机溶剂与水相之间的相间张力，相分离条件温和，因而会保持绝大部分生物分子的活性，可直接用在发酵液中。⑤影响双水相体系的因素比较复杂，可以采取多种手段来提高选择性或提高收率。⑥操作条件温和，整个操作过程在常温常压下进行。⑦不存在有机溶剂残留问题，高聚物一般是不挥发性物质，因而操作环境对人体无害。⑧亲和双水相萃取技术可以提高分配系数和萃取的专一性。3.4双水相萃取的应用生物工程技术中物质的提取与纯化中草药有效成分的提取双水相萃取分析稀有金属、贵金属分离一、实验目的1、了解双水相萃取在生物活性物质提取中的重要作用与意义，及其与传统溶媒萃取技术的异同。2、加深对分配系数K、相比R、收率Y等基本概念的认识及相图的制作，掌握液液萃取中基本实验技术。二、实验原理双水相萃取技术是分离纯化蛋白质混合物等生物大分子的有效方法。双水相系统通常是由水溶性的两种聚合物组成或一种水溶性聚合物与一种盐组成，相对于传统溶剂萃取来说，双水相萃取的最大优势在于双水相体系可为生物活性物质提供一个温和的活性环境，因而可在萃取过程中保持生物物质的活性和构象，而且双水相技术具有处理量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。

二、实验原理生物大分子在双水相上相和下相的浓度比被定义为分配系数（K=Cb/Ct）。在双水相系统中有许多因素影响分配系数，包括系统本身的因素如系统组成、聚合物分子量、聚合物浓度、盐和离子强度、pH等，以及目标产物的性质如疏水作用、电荷、分子量等，通过大量实验研究可以获得特定蛋白质和生物大分子的最适宜分离的相系统和最优分配的。二、实验原理本实验选用PEG400-(NH4)2SO4为双水相系统，从发酵液中萃取糖化酶。收率相比式中:Cb、Ct分别为下、上相酶浓度（活性）；

Vb、Vt

分别为下相、上相的体积。物料衡算：加入的原液总酶活=上相酶活×上相体积+下相酶活×下相体积

三、实验仪器与药品仪器：天平、恒温水浴、离心机、液相混合器、刻度试管、吸管及酸式滴定管等药品：糖化酶PEG400、(NH4)2SO4、2%可溶性淀粉、0.15mol/LNaOH、1mol/LH2SO4四、实验步骤：（一）PEG400-(NH4)2SO4双水相系统相图的制作

1.在具塞三角瓶中准确称量7g左右的PEG400,再加入5ml水（此时体系澄清）。

2.慢慢加入40％(NH4)2SO4溶液（已经配好），不断摇匀，直至试管开始出现混浊为止,记录加入的(NH4)2SO4量；

四、实验步骤：3.再加入适量水（水的加量按实验记录部分的表依次进行）,使体系变澄清，并继续加入40%(NH4)2SO4，使系统再次变混浊；次数水体积(ml)水的重量（g）40％硫酸铵溶液硫酸铵（非溶液）累计量（g）总溶液体系累计量（g）PEG含量％（g/g）硫酸铵含量％（g/g）gml154.941.261.110.50413.2953.353.79232.953.222.801.79219.4636.439.21333.018.226.925.0830.6923.1016.55432.9512.4110.4110.04446.0515.4021.81554.9724.6321.6019.89675.659.3726.30四、实验步骤：4.如此反复操作，计算达到混浊时PEG和(NH4)2SO4在系统中的重量百分浓度，得出PEG和(NH4)2SO4的双节线图。四、实验步骤：PEG400

0.700gH2O5ml(NH4)2SO4混和

H2O0.3/0.5ml浑浊记录(NH4)2SO4ml数混均澄清旋涡器四、实验步骤：（二）双水相系统中蛋白质分配系数的测定1.用干燥的刻度试管称取适量PEG400，再加入适量40%(NH4)2SO4溶液，加入适量水补足到30ml，在混合器上混匀，再加入1ml酶液，于混合器上混合2min。然后离心5min。2.取出读取上、下相体积及总体积，按表二中所示的稀释倍数取样稀释后，分别测其酶活。酶原液稀释20倍测定。3.酶活测定方法见测得酶活性。四、实验步骤：编号PEG加入量（ml）40%硫酸铵加入量（ml）PEG含量硫酸铵含量PEG相（上相）水相（下相）相比分配系数收率%体积测得酶活稀释倍数体积测得酶活稀释倍数A3210.09680.27105.25663028.756310.18331.4285.18%B6210.19350.27101370102190.61977.7897.97%C911.250.29030.1452245310432.412.3396.73%D9210.29030.271016.55517.514.50.94337.9397.28%五、实验结果与讨论：