不同保存条件下对血液乙醇含量测定结果的影响

不同保存条件下对血液乙醇含量测定结果的影响摘要：建立血液中乙醇含量的自动顶空气相色谱质谱检测方法（HS-GC-MS）；考察静脉血和心脏血中乙醇在不同保存条件下的稳定性。通过研究静脉采血消毒剂及消毒操作过程对血液中乙醇含量的影响，探讨采血对样本的可能污染来源及对血液中乙醇含量的影响。论文通过研究血液中乙醇含量的测定过程，分析采用HS-GC-MS法测定血液中乙醇含量的不确定度来源，给出采用该方法测定血液中乙醇含量的检测结果的合成标准不确定度和扩展不确定度。本文建立了HS-GC-MS法测定血液中乙醇含量的质控图，为实验室开展日常酒驾检测结果的质量控制提供保障。关键词：气相色谱；血液；乙醇；Abstract:toestablishanautomaticheadspacegaschromatographymassspectrometry(HS-GC-MS)forthedeterminationofethanolinblood,andtoinvestigatethestabilityofethanolinvenousbloodandheartbloodunderdifferentpreservationconditions.Bystudyingtheinfluenceofvenousbloodcollectiondisinfectantanddisinfectionprocessonthecontentofethanolinblood,thepossiblesourcesofbloodsamplingandtheinfluenceofbloodsamplingonthecontentofethanolwerediscussed.Bystudyingthedeterminationprocessofalcoholcontentinblood,thesourcesofuncertaintyinthedeterminationofethanolcontentinbloodbyHS-GC-MSwereanalyzed.Thestandarduncertaintyandexpandeduncertaintyoftheresultsofthedeterminationofethanolcontentinbloodweregiven.AqualitycontrolchartforthedeterminationofalcoholcontentinbloodbyHS-GC-MSisestablishedinthispaper,whichprovidesaguaranteeforthequalitycontroloflaboratoryresultsofdailyalcoholdrivingtestinthelaboratory.Keywords:gaschromatography;blood;ethanol;

目录一、顶空气相色谱法测定血液中乙醇的含量及血液保存条件的影响 4（一）仪器和试剂 4（二）试剂的配置 4（三）实验方法 51.标准曲线的绘制 52.血液样品的测定 53.血液保存条件对乙醇含量的影响 5（四）结果与讨论 61.标准曲线与线性关系 62.平衡时间的影响 7二、血液中乙醇含量检测结果的影响因素及质量控制研究 8（一）实验 81.仪器 82.试剂 83溶液配制 9（二）顶空一气相色谱一质谱条件 91.顶空条件 92.气相色谱条件 9（三）实验方法 9（四）采血消毒对乙醇污染的影响 101.对象及条件 102.分组和采血 10（五）结果与讨论 11三、直接进样气相色谱法测定血液中乙醇的含量 12（一）仪器和试剂 12（二）实验方法 131.外标标准曲线的绘制 132.内标标准曲线的绘制 133.血液样品的测定 13（三）结果与讨论 141.基体效应 142.标准曲线与线性关系 143.测定结果比较 15结论 15参考文献 16

一、顶空气相色谱法测定血液中乙醇的含量及血液保存条件的影响（一）仪器和试剂在下表1.1中所展示的是此次实验所使用的仪器和相关试剂，在下表1.2中展示的是此次实验仪器操作的相关参数，除了柱温，其他各项都依照着公共安全行业的相关要求来实施。表1.1仪器设备及试剂一览表表1.2仪器工作参数一览表（二）试剂的配置（1）对于乙醇标准溶液予以制备，取无水乙醇（2000）放在的容量瓶中，然后加水实施定容并摇晃混合均匀，获得乙醇标准储备容液（2000/）。称取此储备溶液6份，分别为0.50，1.00，2.00，4.00，8.00以及10.00，然后置入提前添加了蒸馏水的容量瓶中，加水定容至刻度并摇匀，得到浓度分别为10，20，40，80，160以及200mg/的乙醇标液。（2）对于叔丁醇标准液予以制备，取无水叔丁醇2000放在的容量瓶中，然后添水予以定容并摇晃混合均匀，获得叔丁醇标准储备溶液（2000/）。精取0.1此溶液置入提前添加了蒸馏水的容量瓶内（），然后再添水予以定容，并且要摇晃混合均匀，最终获得浓度是2/的叔丁醇标液。（三）实验方法1.标准曲线的绘制利用移液枪精取空白全血共6份，然后分别放在6个顶空瓶（20）中，再添加标液进而制备成乙醇的含量分别是5，10，20，40，80，100/的血样。依次对这六个顶空瓶添加的2/叔丁醇来当做内标，然后用聚四氟乙烯薄膜以及硅橡胶对瓶口予以密封，最后使用压盖器对铝盖予以压实。将顶空瓶中的溶液充分混匀，把其放在70的水浴箱中进行12的加热处理，最后吸取上层气体l并实施进样检验。根据检验所得的数据实施内标标准工作曲线绘制，其纵坐标代表着准备检测的乙醇和内标物叔丁醇两者之间的峰面积比值，而横坐标则代表着乙醇和叔丁醇在含量方面的比值。2.血液样品的测定从准备检测的血液内精取l.0，添加0.5叔丁醇之后，按序使用聚四氟乙烯薄膜和硅橡胶密封垫对顶空瓶进行密封，最后使用压盖器将铝盖予以压实，在充分混匀之后把其放在70的水浴箱中进行12的加热处理，最后吸取上层气体1实施进样检验。3.血液保存条件对乙醇含量的影响分别制备出乙醇含量是20、40、100/的3种血液样品，并且把每个样品分为四份。在贮存方面分为下面几种：（1）密封之后在室温（25-30）环境中予以贮存；（2）密封冰箱保存（(4-8）；（3）在室温环境中予以敞开贮存；（4）在冰箱中进行敞开贮存。最后对于以上各个贮存方法中的血样实施不同时间的检测（立即检测、1d后检测、3d后检测以及一周后检测，最终得出相应的乙醇浓度状况。（四）结果与讨论1.标准曲线与线性关系根据上文的实验方式制作出标准曲线，对于所有血样均实施两次的平行检测，将标准血样的浓度当做X，将乙醇和叔丁醇两者的峰面积比值当做Y，从而制作出过原点线性方程为：。其中的0.2492是相关系数，最终绘制出标准曲线在下图1.3中展示：图1.3因为按照行业标准仪器的相关要求难以有效的分离叔丁醇与乙醇，也无法获得最好的色谱流出图。故而，在这一章节中主要是对于色谱柱的相关柱温实施了多种条件实验。分析后得出影响柱效的主要因素包括流动相流速、填料的颗粒大小以及色谱柱温三大方面。而对于气相色谱来讲，柱温就成为了最为关键的一个影响因素，故而，挑选柱温也成为了挑选仪器的重要条件之一，由于其能够对于色谱柱的柱效与分析效率均会形成较大的影响。一般来讲，挑选柱温的前提条件就是保障混合物内的全部构成部分均可以非常好的分离，以此为基础，尽量使用比较低的温度。当增高柱温的时候，可以减短分析所需要的时间，能够有效提升工作效率；当柱温降低的时候，则可以让色谱柱有着更强的选择性，让其使用寿命增长，并且能够让色谱柱稳定性增大。按照上文1.3中的相关实验方式，其他条件相同，自150开始慢慢减小柱温，分别使用标准血样为/,20/100,80/实施检测和对比。这里采用/当做例子予以介绍，在图1.2中展示的是150柱温的相应色谱图，依照定性实验能够知道：当保留的时间是2.83的为叔丁醇，而保留的时间是3.63的就为乙醇。在图1.3中所展示的是120柱温的相应色谱图，依照定性实验能够知道：当保留时间是4.99的就为叔丁醇，而保留的时间是7.72的就为乙醇。从图示能够知道，紧随柱温的减小会让保留时间逐渐增大，在分离度方面也表现的更好。在实施了数次研究后得出，以实验预定色谱条件为基础，在120的时侯，则乙醇和叔丁醇具有着最佳的分离状况与峰形，并且在杂质峰方面也影响极小，故而，在此次试验中就选择使用120的柱温。2.平衡时间的影响用移液枪取5mg/的乙醇溶液，的lmg/叔T醇溶液，以及0.2的空白全血放在顶空瓶内，总共需要制备四份，在密封及70环境中保存不同的时间并进行有效的检测。最终的相关数据在下表1.4中详细展示。表1.4从上表1.4能够看出，在加热时间为12的时侯，则得到了乙醇和叔丁醇的最大比值，其较高的乙醇峰面积也反映出此时的反应趋于平衡。由于此次试验使用的是手动顶空进样，所以说会在时间以及温度上出现误差，那么10到12的平衡时间均是可以的，最终选择了12。如下图1.5中所示，（a）一（c）分别为不同保存方式对乙醇含量20，40，100mg/血样的影响结果，血液在室温中贮存，不管是不是密封均会产生乙醇含量改变，尤其是含量为40/的血液在此种环境贮存3d则乙醇会全部挥发，而在室温密封贮存条件中也会在一周时间将乙醇全部挥发。在冰箱（4-8）中予以贮存的血样，当处于密封时则一周时间也并未产生明显的变化，然而在敞开条件下却降低很多，并且是浓度越高时则降低的就越快。故而，对于血样需要保存一段时间时，一定要给予密封和冰箱储存，从而才可以保障检验的结果更真实，才可以为一些酒后驾车的鉴定事件提供更有力的根据。图1.5不同保存方式对血液中不同乙醇含量的影响二、血液中乙醇含量检测结果的影响因素及质量控制研究（一）实验1.仪器和试剂此次试验所使用的仪器设备及试剂：自动顶空-气相色谱-质谱系统（），其配置了0.1定量镍管进样环以及20的顶空瓶；气相色谱-质谱联用仪器（），配置了电子轰击离子源；超纯水仪；能够予以调节的移液器（吉尔森，P1000，P200与P100）；7号针头；真空抗凝采血管；乙醇标液；叔丁醇（99.8）；去离子水（）则是通过超纯水仪（）予以配制的；TI型安尔碘消毒液（乙醇65-75）；醋酸洗必泰消毒液（无乙醇）。2溶液配制对于叔丁醇标液的制备：在室温环境中称取40叔丁醇溶液放在提前盛有合理数量去离子水（）的500容量瓶内，使用去离子水进行稀释后摇晃混合均匀，最终制备出叔丁醇储备液（0.l0/）500，然后放在4冰箱中保存。精密度与回收率样本制备：抽取相同空白血样共四份，然后分别加入乙醇标液，让血液内所含的乙醇浓度是0.04，0.20，1.00与5.00/。（二）顶空一气相色谱一质谱条件1.顶空条件炉温设置为60予以20平衡处理，并选择中速振摇。线温度为90，在进样时选择3的时间间隔，另外在样品瓶的加压、定量环冲入和进样等均耗时大概10s。2.气相色谱条件在色谱柱方面主要是使用毛细管柱,，柱温是60并且要保持1.8；使用的载气是氦气（纯度>99.999），其流速则是1/；在进样口的温度是150，并采用了分流比是1：30予以进样。3.质谱条件离子源与传输线都是250，在电离方法上是电子轰击，而电离能为70eV。在溶剂切除的时间上为1.2；扫描选用了离子监测方式（）且为0.ls间隔；乙醇与叔丁醇两者的监测离子是m/z=29，31，45，46和m/z=41，43，57，59，定量离子分别为m/z=45和m/z=59。（三）实验方法对于贮存温度与时间影响心脏血液样本中乙醇稳定性的测验，此实验共选择了20例血液样本，初始的浓度分别是：9.4、42.8、44.3、52.6、87.7、91.9、100.0、105.9、143.1、143.2、156.1、158.4、162.8、171.8、189.9、231.2、235.6、279.2、322.9以及323.9/；编号是120号。将这20例样本每一例均分为3份，并分别放在Ep管内，每个管内放置0.75；在血液样品的贮存时间方面分别为Oh、2h、6h、12h、24h、168h（一周）、336h（两周）以及720h（一个月）；在其贮存的温度方面分别为室温（大概为25）、4与零下18；此次检测要重复两次的平行检验，然后对其结果实施统计学软件处理，然后给予方差分析以及配对t测验，在结果方面则采用了“”来表示。以p<0.05为差异有统计学意义；在重复测定方差分析的时候，首先实施的球形度测验，并将当做未满足球形分布假定，应实施自由度调整，在调整系数方面则为（下面简称）；对于贮存温度与时间影响静脉血液样本中乙醇稳定性的测验，此次检测取10例静脉血液样本，在初始浓度方面分别是22.8、21.9、19.2、18.4、25.1、90.5、93.5、91.9、97.4以及96.1/。在贮存时间方面为0h、24h、48h与72h；在贮存温度方面为25；此次测定实施平行检验两次，然后对相关数据采用统计学软件予以处理，并采用配对t测验，最终的结果则是采用来表示。（四）采血消毒对乙醇污染的影响1.对象及条件共有30名参加研究的志愿者，男、女各一半，在年龄方面是从20岁到55岁之间，在身体方面均为健康人群。志愿者在进行采血之前的48h都没有饮酒，另外在饮酒史的影响方面也经由自身对照实施剖析，故而可以忽略不计。2.分组和采血将志愿者分成3组，每个组包括5名男性和5名女性。对第1组采用II型安尔碘消毒液清洁右肘静脉位置消毒，并在消毒剂还没有干燥时就进行采血；对第2组采用一样的消毒剂，但要在消毒剂干燥30s之后才进行采血；同时对于第1和2组的左肘静脉位置使用醋酸洗必泰（无乙醇）实施一样的消毒方式以及采血；对于第3组采用II型安尔碘消毒液处理左肘静脉，在没有干燥时就实施采血；同时在右肘实施相同方式消毒，但要干燥30s之再予以采血。在此次实验中，对于第1和2组的抽血着均使用干燥棉签压穿刺点并拔针，对于第3组则是使用了安尔碘消毒液浸润后的棉签压穿刺点并拔针。具体的消毒和采血环节情况在下表2.1中展示。表2.1（五）结果与讨论1.GC-MS监测离子的选择在上图中的色谱图：a为甲醇，b为乙醇，c为叔丁醇，d为正丙醇。采用全扫描方式进行数据采集，扫描的质量范围是29^}1SOu，来确定叔丁醇和乙醇的定性与定量离子，在得到的质谱图和谱库内挑选出叔丁醇与乙醇的相应特证离子。其中的叔丁醇采用59来当做其定量离子，乙醇采用45来当做其定量离子。三、直接进样气相色谱法测定血液中乙醇的含量（一）仪器和试剂在下表3.1中所展示的是此次实验所使用的仪器和相关试剂，在下表3.2中展示的是此次实验仪器操作的相关参数，各项分析条件都依照着公共安全行业的相关要求来实施。3.13.2仪器工作参数一览表3.2.2试剂的配置对于乙醇标准溶液予以制备，取无水乙醇（2000）放在的容量瓶中，然后加水实施定容并摇晃混合均匀，获得乙醇标准储备容液（2000/）。称取此储备溶液5份，分别为0.25，1.00，2.00，4.00以及8.00，然后置入提前添加了蒸馏水的容量瓶中，加水予以定容并摇晃混合均匀，最后获得浓度分别是5，20，40，80以及100/的乙醇标准液。对于6的高氯酸溶液予以制备，先精取高氯酸6.0并置入100的容量瓶中，然后添水予以定容并摇晃混合均匀，此时即获得6高氯酸液。对于无水叔丁醇标液予以制备，取无水叔丁醇2000放在的容量瓶中，然后添水予以定容并摇晃混合均匀，获得叔丁醇标准储备溶液（2000/）。精取0.5此溶液置入提前添加了蒸馏水的容量瓶内（），然后再添水予以定容，并且要摇晃混合均匀，最终获得浓度是10/的叔丁醇标液。（二）实验方法1.外标标准曲线的绘制将浓度为5，20，40，80，100mg/的乙醇标液均量取1进样，然后去获得它们的峰面积，各个浓度均平行进样三次，然后制作出外标标准曲线，其中的纵坐标是乙醇峰面积，而横坐标是乙醇的浓度。2.内标标准曲线的绘制精取0.4浓度分别是5，20，40，80，100mg/的乙醇标液，然后放在顶空瓶内，再分别添加0.2的10/叔丁醇与0.2的高氯酸（6%）并充分混匀，最后精取1予以进样并详细记录它们的峰面积，各个浓度的样品要实施平行进样三次的检测，依此制作出内标标准工作曲线，其纵坐标是准备检测的构成部分（乙醇）和内标物（叔丁醇）所具有的峰面积比值，而横坐标则是乙醇和叔丁醇两者的含量比值。3.血液样品的测定外标方式：精取0.4全血放在离心管中并添加0.4的高氯酸溶液（6），然后摇晃混合均匀达到反应充分，其中的蛋白质能够完全沉淀，再进行4000r/离心处理5，最后精取1上层清液来实施进样。内标方式：精取0.4全血放入离心管并添加0.2叔丁醇（10/）与0.2的高氯酸（6），摇晃混合均匀达到反应充分，其中的蛋白质能够完全沉淀，再进行4000r/离心处理5，最后精取1上层清液来实施进样。（三）结果与讨论1.基体效应现如今，在环境检验中常常使用的是相对分析法，此类使用了“纯物质”配制的标液和现实环境样品有着较大的差异。而因为此类多方面的性质差异所造成的实际检测误差就被称为基体效应。由于理论意义上的乙醇加入空白全血进行实验是缺乏现实意义的，故而，在此次实验中就讨论直接使用乙醇标液来当做空白对照的相关问题。利用移液枪称取0.2空白血样并且和200乙醇标液均放入试管内，再添加0.4高氯酸（6）后进行摇晃使其混合均匀，再进行离心处理后精取上层清液来实施色谱分析。最后的实验结论在下表3.3中展示。3.3血液蔽休和基馏水疾体对比2.标准曲线与线性关系采用相同的色谱条件，并借助于直接进样气相色谱方式去制作外标曲线与内标曲线，获得了两种方式的回归方程，在下图展示的就是相关系数与线性范围。从这些图能够知道，相关系数r均＞0.999，而线性范围均处在0-300/内，全部达到了此次检验的要求。3.测定结果比较采用空白血液来制备乙醇浓度分别是5，20，80/的三类血样，再分别借助于内标法与外标法实施6次平行检测，最终的结果在下表3.4中展示，采用格鲁布斯方法对于此类数据予以测验，并未显示出异常情况。表3.4内外标法测定乙醇含量的数据结论在这篇文章中创建了自动顶空一气相色谱一质谱检验方式，并借助于色谱分离与质谱定性功能去对样品内所含的乙醇数量实施了比较快和比较精准的检测，在用样数量方面仅为0.20，也是此方式的一个优势。采用自动顶空分析方式，无需太复杂的处理程序，并且有着比较快的分析速度，在样品数量比较多的时候还能够借助于仪器的重叠平衡功能去加快检验的速度。经由此次检测得出，依照标准方式予以静脉采血并使用抗凝剂试管，则能够在室温中贮存超过48h；但是使用不包含抗凝剂的试管，则在贮存温度与贮存时间两方面都具有不同程度的影响，如室温中的心脏血样会在贮存6h之后就出现乙醇浓度增高情况。故而，对于静脉血液室温存放应少于2d，而心脏血室温存放应少于2h，此种方式才能够保障最终结果的真实性和有效性。在此次试验中得出，采血过程中的皮肤消毒对于血液的乙醇含量并未形成影响，但是若在压迫穿