中国海域腹泻性贝毒的分布及危害

中国海域腹泻性贝毒的分布及危害

1腹泻性贝毒的分布腹泻性骨关（sd）是由有毒红藻和原甲藻的一些类型产生的脂肪多环醚类生物活性物质。腹泻性贝毒可在贝等滤食性动物体内富集,危害食用者健康。腹泻性贝毒在全球沿岸海域均有分布,是世界范围内具有最严重威胁的赤潮藻毒素之一。腹泻性贝毒的主要分析方法有液相色谱法、免疫学法以及生物毒性法。腹泻性贝毒包括软海绵酸(okadaicacid,OA)和它的衍生物鳍藻毒素等(dinophysistoxins,DTX1-3)、扇贝毒素(pectenotoxins,PTX1-10)、硫酸化衍生物虾夷扇贝毒素(yessotoxins,YTXs)、氮杂螺环酸毒素(azaspiracidpoisoning,AZP)、螺旋形亚胺(gymnodimine,GYM)化合物等。腹泻性贝毒DSP在我国存在比较普遍,近年来每年均有发现腹泻性贝毒的报道,危害有不断加重的趋势。近年对我国沿海部分海域贝类毒素分布调查显示,在渤海湾、胶州湾、莱州湾、秦皇岛、广东沿海和福建等海域均发现了DSP。在胶州湾海域发现产DSP的毒藻渐尖鳍藻(Dinophysisacuminata);1998年渤海湾发生的大面积赤潮中,发现的倒卵形鳍藻(Dinophysisfortii)也可产生DSP;1997年至1998年广东沿海发生的多次赤潮中,能产生DSP的利玛原甲藻(Prorocentrumlima)和具尾鳍藻(Dinophysiscaudate)均以优势赤潮藻类存在;在黄海、东海和南海也都发现具尾鳍藻。迄今为止,我国已有多种贝类沾染腹泻性贝毒。腹泻性贝毒素最初是指软海绵酸OA和它的衍生物鳍藻毒素DTXs,而扇贝毒素PTXs、虾夷扇贝毒素YTXs和氮杂螺环酸毒素AZP等在结构、毒性上与OA有差异,但因为这几种毒素成分通常在贝中与OA和DTXs共存,一直以来也被归为腹泻性贝毒素;而GYM在产毒藻、结构和毒性上与其他几种组分都是不同的,但因其脂溶性,在检测腹泻性贝毒的萃取过程中会一并提取,所以一直将其归为腹泻性贝毒;FAO/IOC/WHO于2004年3月在都柏林(Dublin)举行的关于贝类生物毒素会议上,重新按化学结构将贝类生物毒素分为8组,GYM属于环亚胺(cyclicimine)毒素组,这一组还包括spirolides、pinnatoxins、prorocentrolide和spirocentrimine。1994年首次在新西兰Foveaux海峡的牡蛎(dredgeoysters,Tiostreachilensis=ostreachilensis)中检测到高浓度的GYM(大于20mg/kg)。在新西兰GYM是普遍存在的,在多种贝和鲍鱼中检测到GYM。到目前为止,GYM在贝中的报道还仅限于新西兰、突尼斯和澳大利亚。GYM具有一个螺旋形的环亚胺结构(见图1),已经至少发现鉴定了5种结构,包括GYMA,GYMB和GYMC。腹泻性贝毒是对人类健康具有极大潜在威胁的海洋生物毒素,因而对生态环境及水产养殖业形成严重的威胁。我国腹泻性贝毒的研究比较滞后,只有一些使用小鼠生物法检测的报道,以及几篇液相衍生荧光检测贝类样品的报道。在我国贝类中已发现报道的腹泻性贝毒成分仅有软海绵酸OA和鳍藻毒素DTX-1。可能是因为不够重视,研究的比较少,特别是标准物质的极度匮乏导致。为了了解我国贝类中存在的腹泻性贝毒成分,我们采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)方法对我国海产贝类中的腹泻性贝毒组分进行分析。2材料和方法2.1回复突变物的检测贝类样品来自国家专项908“赤潮、海洋病原生物和外来生物入侵灾害调查与研究”(908-01-ZH3)课题在全国沿海采集的贝类样品,在小鼠生物法检测阳性的样品中挑选了12个毒性最大的样品,站位和种类见表1。进行HPLC-MS/MS分析。贝样去壳匀浆,2g匀浆加入8mL萃取液(80%的甲醇-水,V/V)超声10min,离心,上清用于HPLC-MS/MS分析。2.2阳离子模式nm检测小鼠生物法(MouseBioassay,MBA)参照中华人民共和国进出口商品检验行业标准“出口贝类腹泻性贝类毒素检验方法”(SN0294)。GYM的HPLC-MS/MS分析方法:质谱API365三重四极杆质谱检测器;自动进样器ShimadzuSIL-10AD;泵ShimadzuSIL-10AT(2);色谱柱LunaC18(2)5μ色谱术的长度和直径为150mm×2.0mm;保护柱为Phenomenex;阳离子模式。检测器参数NEB:14DP:50CUR:8FP:200IS:3000EP:10TEM:450CXP:15碎片离子:508>490/508>392流速:0.3mL/min流动相A:5mmol/dm3甲酸胺,53mmol/dm3甲酸,乙腈/水(体积比为10∶90);流动相B:5mmol/dm3甲酸胺,53mmol/dm3甲酸,乙腈/水(90∶10,V/V);梯度洗脱程序指标见表2;进样体积:20μL阳离子模式检测的其他毒素的m/z:PTX-1892>839/892>213,PTX-2876>823/876>551,AZA-1842.5>824.5/842.5>806.5,AZA-2856>838/856>820,AZA-3828>810/828>792。负离子模式分析毒素的质谱条件:Nebulizergas(NEB)13,Curtaingas(CUR)12,Ionspray(IS)-4500.00,Collisiongas(CAD)8,Entrancepotential(EP)-8,Collisioncellexitpotential(CXP)-51。表2为负离子模式分析毒素的组分及离子对m/z等。3gyn毒素的变化12个样品中,只在广西北海的缘齿牡蛎(Dendostreacrenulifrea)中检测出12μg/Kg的GYM毒素成分(见图2,3);另有8个样品检测出含有YTXs毒素(结果另文发表)。这是首次在我国贝类中发现GYM毒素成分。图2为GYM标准品的色谱图,GYM在ESI+模式下分子离子为508.3,后经能量碰撞,产生两个主要的碎片离子为490.3和392.3,两个碎片的丰度比如图所示,色谱峰的保留时间为17.34min;在含有GYM的缘齿牡蛎样品色谱图中,在与标准品相同的监测模式下,得到与标准品相同的碎片离子对508.3/490.3和508.3/392.3,两个碎片离子的丰度比与标准品的谱图相同,且色谱峰的保留时间为17.23min(样品中GYM保留时间前移的原因主要是样品中基质的干扰,PH值比标准品溶液高,更偏碱性,在C18反相柱上会前移)。因此断定该样品中含有GYM毒素。在我国贝类样品中检测到GYM是未曾预料到的。GYM能导致鱼类等大量死亡;能够证实GYM具有促进肿瘤形成的作用;GYM与环亚胺组其他毒素一样,当含量高时,贝的脂溶性萃取物对鼠的腹腔注射急性致死毒性很高(fastactingtoxins,FAT),大约在3～20min实验鼠死亡,具有神经中毒症状,因此干扰鼠生物法检测OA毒素、神经性毒素和AZP毒素的结果;当含量在亚致死浓度时,实验鼠会很快恢复正常;没有口服毒性或很小;尚未有人因食用染毒贝致病的证明报道。含有GYM的缘齿牡蛎样品的小鼠生物实验现象与文献报道的完全一致,脂溶性提取物的生理盐水(含1%的土温-60)溶液经腹腔注射小鼠,3只鼠立刻出现摇晃、串动、抽搐等症状,然后翻躺、不动,在3h内全部死亡,连续稀释3次进行注射,3只鼠均在24h内死亡,一直到8倍稀释,3只鼠中2只24h内死亡,另1只24h活力较好。按毒力标准表计算,毒性为0.4MU/g。是所有样品中毒性最高的。这个样品不含有OA,DTX-1,PTXs,YTXs和AZAs毒素成分,只检测到GYM。这一组快速作用毒素,结构中的亚胺是毒理作用不可或缺的,但关于GYM的详细毒理作用机制目前尚不清楚;也没有任何关于GYM毒素的吸收、分布、降解和代谢的生理学数据,没有亚急性和慢性毒性的数据;是否有安全限制意义尚不确定。与OA,DTXs,PTX和YTX几种组分主要累积在贝的消化腺中不同,GYM主要存在于消化腺以外的肌肉组织中,这可能是由于GYM的结构特点导致的,其他毒素都具有中性到酸性的性质。GYM的降解代谢相当缓慢,它可以在贝中以持续稳定的浓度存在5个月以上,而在这个时间内其他腹泻性毒素成分已经逐渐降解消失,新西兰FoveauxStrait的牡蛎中的GYM在最初沾污后一直持续存在几年时间,这表明GYM是一种长期残留的毒素成分。GYM毒素成分的来源生物是一种凯伦藻,最初被定为Gymnodiniummikimotoi/nagasakiense种,最近又被重新描述为K.selliformis种。这种有毒的甲藻在新西兰海域存在很久了,尽管这一特定种的甲藻赤潮非常罕见,但类似种甲藻的赤潮却相当普遍。通常GYM在贝中的沾污浓度比较低,因为K.selliformis通常以相当低的丰度在海水中存在。我国至今为止尚未有存在Kareniaselliformis种的报道。关于凯伦藻属(Karenia)在我国发现的有2种,短凯伦藻(Kareniabrevis)和米氏凯伦藻(Kareniamikimotoi)。短凯伦藻(K.brevis)又叫腰鞭毛藻,在我国广东沿岸、大亚湾和大鹏湾水域均有分布,该藻可以产生神经性贝毒(NeurotoxicShellfishPoisoning,NSP),但我国尚未发现此种海洋生物毒素;米氏凯伦藻(K.mikimotoi)为世界广布种,是日本近岸水域的主要有毒赤潮藻类,在我国厦门海域曾有此种的赤潮记录,特别是1998年4月在广东珠江口、2004年6月在渤海湾和黄河口发生了本种的大规模赤潮,米氏凯伦藻是有毒藻类,能分泌溶血毒素等有毒物质,可引起鱼类和海洋无脊椎动物死亡;2种新记录的凯伦藻K.areniadigita和K.longicanales近年在珠江口、深圳、香港和珠海水域发现。关于我国缘齿牡蛎中的GYM毒素的来源生物有2种解释,其一可能是我国已经存在产毒藻K.selliformis,由于我国浮游植物鉴定大多采用传统的形态学镜检方法,尚未发现鉴定。据报道在新西兰存在5种凯伦藻(Kareniaspecies),而它们在形态学上非常相似,极难区分鉴定,LesleyRhodes等发明了一种DNA探针(RibosomalRNA-targetedDNAprobes),专门用于4种凯伦藻K.mikimotoi,K.selliformis,K.brevisulcata和K.papilionacea的鉴定分析。另一种可能就是在我国存在其他的产生GYM毒素的藻等微生物。关于我国贝中GYM毒素的来源尚需深入的研究。本文只分析了12个小鼠法阳性的贝类样品,只有一个样品检出GYM毒素,由于样品数量极其有限,以及生物小鼠法分析GYM毒素的准确性尚无确实的研究数据,因此不能得出GYM毒素的存在状况,关于我国贝中GYM毒素的分布特点尚需大量深入研究。虽然GYM毒素口服毒性很低,但关于其长期、低剂量暴露的健康风险正引起极大关注。目前我国腹泻性贝毒监测主要使用小鼠生物法,这一方法误差大、干扰因素多、重复性差,存在假阳性的缺点,据吴施卫等的报道,使用小鼠法在我国多种贝中检测到高含量的腹泻性贝毒,包括菲律宾蛤仔、毛蚶、紫贻贝等多种常见经济贝类;陈则玲、刘仁沿和邬建勇报道使用高效液相色谱衍生荧光方法,在我国大连湾的菲律宾蛤仔消化腺内检测到OA、铜川的海湾扇贝中含OA和DTX-1组分;衍生荧光法背景干扰比较大,存在一定的定性误差,而且分析处理过程繁琐复杂,不易操作,只适用能够引入衍生基团的几个组分;方晓明等采用飞行时间质谱技术,研究了OA的分析检测方法,得到了很好的检出限等指标,特别适合极低含量的样品分析,但没有大量实际样品的分析检测结果,而且飞行时间质谱仪因昂贵,很不普及,不利于推广应用;高效液相色谱结合串联四极杆质谱仪是目前分析测定生物毒素,特别是脂溶