一种利用碱性蛋白磷酸酶活力变化检测的生物化学测试方法

一种利用碱性蛋白磷酸酶活力变化检测的生物化学测试方法

1成对成模检测方法的发展近20年来，有害红芽在全球范围内迅速爆发，其中有毒红芽和藻类毒素问题日益突出。赤潮藻毒素通过食物链传递在鱼、贝类体内累积,会造成严重的海产品食用安全问题。腹泻性贝毒(DSP)是一类较为常见的赤潮藻毒素,其中大田软海绵酸(OA)和鳍藻毒素(DTXs)能够导致人们严重的胃肠功能紊乱,发生腹泻、呕吐和腹痛等中毒症状。尽管OA和DTXs没有显著的急性毒性效应,迄今为止还没有中毒死亡事件发生,但其能够抑制蛋白磷酸酶活力,导致蛋白过磷酸化,是一类潜在的肿瘤促进因子,其长期毒性效应值得关注。由于DSP的污染已波及亚太和欧洲沿海各国。因此,人们非常关注对其检测方法的研究。目前,用于OA和DTXs检测的方法主要有小鼠腹腔注射法、酶联免疫法、细胞毒性测试法、酶活力抑制分析法高效液相色谱法以及液相-色谱质谱联用等方法。每种方法都有其优缺点,其中小鼠法和液相色谱法使用较多。在小鼠法中,由于DSP的提取过程复杂,易受杂质干扰,假阳性结果时有出现,而且需时较长(通常需24h),检出限偏高(200μgOAeq./kg贝组织),重现性较差,因此,该方法一直未能发展成为测试DSP的标准方法。而液相色谱法分析DSP需要条件苛刻的衍生过程(部分化合物需在-80℃条件下储存),难以避免杂质干扰问题,同时方法本身需要价格昂贵的仪器和专业的人员操作,这些都限制了该方法作为测试DSP标准方法的可能。蛋白磷酸酶2A(proteinphosphatase2A,PP2A)是主要的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶,作用于磷酸化酶激酶的α亚单位,广泛存在于生物的细胞组织中,占细胞总蛋白质的0.05%～0.25%。而OA和DTXs能够高效地抑制PP2A酶的活性,造成细胞内磷酸化蛋白的急剧增加,从而改变肠细胞钠的分泌和细胞膜的通透性,从而导致腹泻,并能够促进肿瘤细胞发育。利用OA对PP2A酶活力抑制的特性,选择一种在酶催化反应后能够产生荧光产物的物质作为底物,依据酶反应过程中产物产生的速率来指示酶活力受抑制的程度,进而计算抑制剂OA的浓度。基于这一原理建立的蛋白磷酸酶活力抑制分析方法成为一种很有发展潜力的DSP测试方法。2003年Quilliam博士在其承提的APEC项目中就此方法组织了不同实验室间的互校工作,利用这一方法,对威海出入境检验检疫局采集的3个牡蛎样品进行了检测。2实验部分2.1样品和标准溶液氢氧化钠(NaOH)、氯化钙(CaCl2·2H2O)、Tris缓冲剂、牛血清蛋白(组分V)等均为AMRESCO进口试剂;氯化镍(NiCl2·6H2O)、4-甲基伞形酮磷酸盐和4-甲基伞形酮购自Sigma公司;盐酸为优级纯;甲醇为色谱纯;胆酸钠为分析纯。实验所用的PP2A酶购自美国Upstate公司,从人血红细胞中提取,含36kDa和60kDa的两个亚基,酶活力约为10U/mL,-18℃储存。OA标准溶液购自加拿大国家研究院海洋生物科学研究所,纯度为98%。酶活力测定采用多通道连续分光/荧光光度计(TECAN/SAFIRE)。2.2酶的制备和贮藏测试溶液A:50mmol/L的Tris缓冲液,pH7.0,低温冷藏;测试溶液B:40mmol/L的NiCl2溶液,室温储藏;测试溶液C:用Tris缓冲液配制10g/L的牛血清白蛋白溶液,低温冷藏;测试溶液D:用Tris缓冲液配制6.7mmol/L的胆酸钠溶液,低温冷藏;测试溶液E:用Tris缓冲液配制1.7mmol/L的4-甲基伞形酮磷酸盐溶液,用作底物溶液;酶测试混合液:将购买的PP2A酶和缓冲溶液混合后,分装为0.1mL/支储藏,每块96孔微孔板需要两支酶,使用时向每支酶中加入0.4mL的Tris缓冲液,得到酶溶液。然后,按照测试溶液A∶B∶C∶D∶酶溶液=2∶1∶7∶2∶2(V/V)比例配制,得到酶测试混合液;空白测试液:用于空白实验,溶液中不含有酶,按照测试溶液A∶B∶C∶D=4∶1∶7∶2(V/V)的比例配制。上述溶液配制过程中使用的水均为由MilliPore净水系统制备的超纯水。2.3样品处理和蒸发(1)将样品解冻后清洗,除去表面的泥沙等杂质,去壳后将生物体匀浆。称量2g匀浆的牡蛎样品,每个样品称量3份,按1∶2(m/V)的比例加入80%(V/V)的甲醇水溶液,使用超声波在200W条件下处理1min,间隔10s;以6000r/min转速离心5min,取上清液。将提取过程重复两次,合并提取液。用5mL正己烷对合并的提取液脱脂两次,合并正己烷相,用于后续的水解处理。向3个样品脱脂后的甲醇相中分别加入2mL0.2%的乙酸溶液,再以4mL氯仿溶液提取两次,合并氯仿提取液。在黑暗条件下将溶液以氮气吹干,并以500μL甲醇溶解(相当于4g贝组织/mL甲醇)。将样品放置黑暗处冷藏保存。(2)将样品2和3在部分脱脂处理后的正己烷相用于水解处理,以分析在贝类中可能存在的OA和DTXs的酯化物。先将正己烷蒸发至干,加入100μL的0.5mol/LNaOH溶液(NaOH溶解在90%的甲醇水溶液中),75℃水解40min。然后,将水解后的溶液蒸发至干,向残余物中加入300μL0.5mol/LHCl,以300μL乙醚提取3次。蒸干溶剂后,将残余物以250μL80%甲醇水溶液溶解,再用250μL正己烷提取两次脱去其它脂类杂质。最后,向甲醇水溶液中加入100μL0.2%乙酸溶液,再以400μL氯仿溶液提取两次。将合并的氯仿溶液蒸发至干,以500μL甲醇溶液溶解(4g贝组织/mL甲醇)。黑暗中冷藏保存。储存的样品在使用前用超纯水稀释6倍,使得样品中甲醇的比例约为16%。2.4牡蛎酶活力检测方法以16%(V/V)甲醇溶液稀释OA标准物质,分别得到0.03、0.15、0.3、0.75、1.5、3、7.5、15、30、100、300和3000nmol/L共12个不同浓度的系列标准溶液,用于制作标准曲线,每一浓度重复3次。测试包括4组:(1)OA标准组用于测定标准OA溶液对酶活力的抑制程度,以绘制标准曲线;(2)阴性对照组用于测定未受抑制的酶活力值,测试体系中含有酶但不含OA抑制剂;(3)空白组用于测定反应体系的背景值,测试体系中既不含酶也不含OA抑制剂;(4)样品测试组用于测定实际样品对酶活力的抑制程度。每一组中的反应液体积均为200μL,其中包括120μL底物溶液,70μL酶测试混合液和10μL测试样品溶液。空白组中以空白测试液代替酶测试混合液;OA标准组中的测试样品溶液为不同浓度的OA标准溶液;阴性对照组和空白组的测试样品溶液均以16%甲醇代替;样品测试组中的样品溶液为稀释后的牡蛎样品储存溶液,溶液中甲醇的比例约为16%。将测试样品溶液(或16%甲醇溶液)和酶测试混合液(或空白测试液)先后加入96孔板后,在37℃条件下孵育10min,然后快速加入底物溶液,启动反应。反应温度为37±0.1℃。使用多通道连续分光/荧光光度计(TECANSAFIRE)每隔2min测量一次样品荧光值,所用荧光激发波长为360nm,发射波长为460nm,连续测量1h。利用线性回归计算酶反应的斜率,以表示酶的活力;以样品的酶反应斜率与阴性对照的酶反应斜率的比值乘以100来反映酶活力的抑制情况,称为相对酶活力;以OA浓度为横坐标,以相对酶活力为纵坐标,利用散点作图得到OA抑制PP2A酶的剂量-反应标准曲线。如果样品是在不同的96孔板上测试,样品的酶动力学反应斜率需要通过阳性对照组的反应斜率进行校正,使得不同批次测试的样品之间可以进行比较。2.5加标样品的制备取威海采集的2号牡蛎样品提取液,向50μL提取液中分别加入50μL初始浓度分别为30和15nmol/L的OA标准溶液,并稀释到300μL,得到含5和2.5nmol/LOA标准的牡蛎加标样品。以此检测牡蛎样品中OA的回收率。3结果与讨论3.1酶活力抑制法与其他检测方法的比较根据不同浓度OA对酶活力的抑制情况,得到OA抑制PP2A酶活力的剂量-反应标准曲线,如图1所示。从图1可知,酶活力的剂量-反应标准曲线在对数坐标上呈“S”形分布。当OA的浓度低于0.75nmol/L(相对酶活力高于90.2%)时,样品测试的重复性降低,3次重复间的标准偏差较大。因此,在此范围内的测试结果不够准确。而当OA浓度在0.75～30nmol/L时,相对酶活力从90.2%急剧下降到35.7%,相对酶活力对OA浓度的变化响应非常明显(拟合方程的斜率为-1.916),且相关性显著(r=0.9390)。当OA浓度在30～3000nmol/L时,相对酶活力从35.7%降低到4.5%,对OA浓度的响应灵敏度大大降低(拟合方程的斜率为-0.009),说明OA浓度高于30nmol/L时工作曲线的剂量-反应灵敏度明显降低。因此,利用该剂量-反应标准曲线计算OA的有效浓度范围为0.75～30nmol/L,在低于或高于这个浓度范围时,方法的准确性和灵敏度会有所降低。与其它检测DSP的方法相比,酶活力抑制法具有许多优点。首先,该方法非常灵敏,准确定量OA的最低浓度可达0.75nmol/L(0.6μg/L),折算成OA的质量为6pg。本研究中使用的最终提取比例为2g贝组织/3mL甲醇水溶液,由此计算得检出限为0.9μgOAeq./kg贝组织。该检出限低于Mountfort等报道的10μgOAeq./kg贝组织,远远低于小鼠生物测试法(200μgOAeq./kg贝组织)和目前许多国家采用的DSP食用安全标准(200μgOAeq./kg贝组织)。即使与高效液相色谱法(100μgOAeq./kg贝组织)相比,该方法的检出限也降低了100倍;其次,这一方法可以给出相对准确的定量结果,通过这一方法所得到的检测结果与液相色谱-质谱联用仪分析结果较为吻合。实验使用液相色谱-质谱联用仪,采用标准加入法对2号牡蛎样品进行了定量分析,得到的工作曲线如图2所示。由图2中工作曲线的斜率说明,2号牡蛎样品的未水解样品中不含有OA和DTX-1毒素,而在水解样品中,3个加标样品的OA和DTX-1的回收率均大于100%,表明水解样品中存在微量的OA和DTX-1毒素。由图2中的工作曲线计算水解样品中OA和DTX-1的含量分别为0.57和0.56μg/kg,折算为OA的毒性含量为1.27μgOAeq./kg。液质分析结果与该方法测试的1.81μgOAeq./kg相比,二者基本相当。由此看来,即便在贝类含毒量低于控制标准100倍时,这2种方法的测试结果仍然具有可比性。González等曾经组织3个实验室就这一方法进行比对,结果表明:该方法具有较好的重现性,相对标准偏差为15%～26%,在低浓度条件下的定量分析结果与HPLC方法有很好的可比性。Ramstad等比较了2种HPLC方法与蛋白磷酸酶活力抑制法对贝类中DSP检测的效果,结果表明这3种方法具有显著的相关性,重现性也非常好。本方法所得的回收率与以往的报道相近。在对不含OA和DTX-1毒素的2号牡蛎样品中按照5和2.5nmol/L的比例加入OA标准毒素,得到的回收率分别为90%和68%。Mountfort等向含低浓度OA(33.7μg/kg)的贝类样品(Mytilusedulis)中按照浓度为100、200和400μg/kg的量加入标准毒素OA,得到的回收率分别为95.6%、81.5%和65.2%,其使用的方法中除了没有加入胆酸钠之外,其余的方法基本相同。由此看来,这种方法在贝类体内DSP的分析中具有较好的回收率。同时,这一方法可以一次性快速分析多个样品,通常一次分析可在10h内完成。因此,可以有效应用于贝类样品DSP的毒性扫描,大大降低检测的工作量。本方法的不足之处是:它同所有的生物测试方法相似,不能给出毒素组成的信息,只能给出反映毒性相对大小的数据;方法所需要的酶价格较高,使用的多通道连续分光/荧光光度计也不普及,这限制了本方法的广泛应用。3.2牡蛎水解过程中的毒素活性牡蛎样品提取液对PP2A酶活力抑制反应的结果如表1所示。由表1可知,3个牡蛎样品的相对酶活力值均高于90.2%,即样品中OA的浓度均低于方法的检出限。牡蛎样品2和3水解样的相对酶活力值均低于90.2%,计算得OA的含量分别为1.81和1.21μgOAeq./kg。从样品的分析结果来看,3个牡蛎样品的未水解处理均未检测出毒性,毒素的含量低于0.9μgOAeq./kg贝组织(检出限)。而编号为2和3的水解处理样品中,毒性的含量分别为1.81和1.21μgOAeq./kg贝组织。这可能是因为牡蛎体内不含OA和DTXs这一类的毒素,所以未水解处理样品没有表现出对蛋白磷酸酶的抑制。但水解处理后的样品中表现出OA和DTXs的毒性,这可能是由于牡蛎体内存在微量的OA和DTXs与脂肪酸形成的酯类化合物,在样品处理过程中,由于其极性较低主要分布在正己烷相中,这些酯类物质不能抑制PP2A酶的活性,但在碱性条件下很容易被水解成DSP的原始形式OA和DTXs。据Marr等报道:OA、DTX-1和DTX-2均可以与C14～C18的饱和或不饱和脂肪酸酰化生成酯类化合物。Vale等发现:贝类体内OA的酯型毒素所占的比例随着OA污染程度的增加而增加,OA在贝体内发生的酰化过程可能是由酶参与的一种脱毒机制,从而降低毒素对其自身的毒害作用。因此,人们建议在进行毒素分析时应该包括这些毒素