医学荧光定量PCR

主

要

内

容❏定量PCR与常规PCR的区别❏荧光定量PCR的原理❏常用的热循环仪❏定量的方法❏重复性和敏感度❏应用❏如何设计荧光定量PCR的方案荧光定量PCR与常规PCR的区别常规PCR技术：对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析荧光定量PCR技术：对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量分析实时荧光定量PCR的特点特异性更强灵敏度高可直接对产物进行定量解决PCR污染问题自动化程度高、操作简单real

time

PCR的扩增曲线Ct值极具重现性PE公司在同一台PCR仪上对相同模板进行96次扩增的扩增曲线图Ct与初始模板的关系·

固定循环数后，荧光信号与模板数成正比固定荧光信号值后，模板数就与循环数成反比初始DNA量越多,荧光达到阈值时所需要的循环数(Ct值)越少起始模板的对数浓度与Ct呈线性关系，根据样品的Ct值就可计算出104

103102Threshold常用的荧光定量PCR试剂SYBR

Green

ITaqman水解探针分子信标SYBR

Green

I·结合到双链DNA的小沟部位·只有和双链DNA结合后才发荧光SYBR

Green

I

工作原理未结合的SYBR

green

I结合解离曲线识别不同的PCR产物95℃15sec;

60℃

20sec;

95

℃15sec在60℃～95℃之间的Ramp

time设为19:59SYBR

Green

I的特点√可以用于不同的模板√使用方便，价格相对便宜√灵敏度很高√与非特异性产物结合√解离曲线√选择良好的引物和探针并优化反应条件TaqMan

Probes荧光素与目标序列互补FAMTETJOEHEXVIC淬灭剂TAMRADABCYLTaqMan

Probes工作原理探针与目标序列配对时，发生

FRET能量转移Taq荧光基团淬灭剂游离的探针光延伸时，Taq酶水解探针，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离而发出荧光，形成荧光信号Taq发出荧光光另一波长的荧光随着扩增循环数的增加，TaqMan探针释放出来的荧光基团不断积累。因此荧光强度与扩增产物的数量呈正比关系TaqMan探针应用基因检测、病毒定量、细胞因子基因定量、癌细胞基因微突变检测等其结果都具有高特异性与高敏感性但只适合于一个特定的目标TaqMan

MGB探针荧光素非荧光淬灭基团与目标序列互补MGB(Minor

Groove

Binder)将探针的Tm值提高10℃因此，MGB探针可以比普通TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大为提高。TaqMan

MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。分子信标(发夹型杂交探针)荧光基团茎由互补配对的序列组成淬灭剂茎(5-7bp)环（15-30bp） 环与目标序列互补FAMTexas

Red探针杂交到DNA模板光发出荧光荧光基团DNA模板茎淬灭剂分子信标工作原理环光淬灭分子信标能特异性地检测感兴趣的目标DNA分子信标可用于单核苷酸多态性的检测特别适用于检测点突变只能用于一个特定的目标设计困难价格较高常用的热循环仪Company

PCR

systemSampleformatMaxsamplenumberApplied

BiosystemsABI

Prism

7700

SDSGeneAmp

5700

SDSABI

Prism

7900

HTSDSMicroplateTubesMicroplateTubesMicroplate969696,

384iCycler

iQSmart

CyclerMicroplateTubesTubes969616Bio-Radwww.bio-CepheidCorbett

ResearchRotor-GeneTubes

Strip

tubes3272ABI

Prism

7700o可以在同一反应体系中同时对多个靶基因分子进行扩增一次可以测定96个样本，并且速度较快，一批样

本的完成只需要2～3小

时用于水解探针、双链

DNA结合染料、分子信标的分析定量——绝对标准曲线方法标准品：纯化的质粒dsDNA，体外转录的RNA准确配制标准系列并且注意其稳定性，最好分装后保存于-80℃荧光材料：杂交探针、水解探针或SYBRGreen

I不可以使用DNA作为标准品对RNA进行定量应用于定量病毒荷载量等定量——相对标准曲线方法指在测定目的基因的同时测定某一内对照基因，用一系列已知外参物做标准曲线，根据该标准曲线得到目的基因和内对照基因的量，再将目的基因的同内对照基因的比值作为定量的最后结果标准品：含有目标基因的DNA或RNA一般选用看家基因校正常选择看家基因GAPDH、β-actin、rRNA在假设样品逆转录效率相同的前提下，可以使用

DNA的标准曲线对RNA进行定量较常用的一种方法比较Ct法假设目的基因与看家基因扩增效率相同，数学推导得出目的基因的量=2-ΔΔCtΔΔCt=(Ct目的基因-Ct管家基因)实验组-(Ct目的基因-Ct管家基因)对照2-ΔΔCt表示的是实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数在目的基因与看家基因扩增效率相同的情况下可以直接得到的目的基因相对于管家基因的定量，而不必制作标准曲线更为简便省时，也是相当可靠的重

复

性

问

题判断实验结果优劣的重要指标主要判断指标为标准差（SD）和变异系数（CV）影响结果重复性的因素PCR反应扩增的效率优化实验条件，使反应体系达到最佳扩增效率目的基因的初始浓度使用初始浓度具有较高数量级的样本或作平行孔标准曲线的影响5个稀释度的标准品，涵盖待测样本中目的基因量可能出现的全部浓度范围理想的标准品应与样本具有高同源性：质粒DNA或是体外合成、转录的RNA影

响

敏

感

度

的

因

素反应体系中形成的引物二聚体的影响可以用水解探针代替SYBRGreenI，有文献报导使用水解探针的敏感性要比SYBRGreenI高出10倍。可以使用热启动办法或使用特殊处理的Taq酶要尽可能地优化引物设计如果反应体系中出现PCR的抑制因素，应适当将目的基因的浓度稀释后再进行扩增。注意避免室温混合各种试剂，并且在一经混合后立即开始进行扩增。循环数应

用对各种基因表达进行定量分析基础研究：不同组织、用药前后、不同发育阶段基因表达······

差异的检测临床：细菌、病毒、寄生虫等病原体的检测

DNA、mRNA病毒荷载量的定量肿瘤相关基因、肿瘤标志物和肿瘤耐药基因的检测食品卫生检疫：转基因食品瘟疫流行地区进口的食品·

点突变分析和等位基因分析如何设计荧光定量PCR实验方案根据拟要研究的基因名称，在genebank中找到相应的基因序列（）采用引物设计软件Primer

Express2.0(Taqman探针或SYBR

Green

I，说明见

/support/apptech

)和beacon

designs3.0进行引物探针的设计软件可在下载➢PCR产物大小在50-150bpTaqMan

探针设计原则保持G-C含量在30-80%之间避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上5’不能是G尽量使探针中的C多于G上述两条如果不能满足，则使用互补链上的探针对于单探针反应，用Primer

Express软件计算出来的Tm值应当在68-70℃之间，比引物高10℃。长度<30bp引

物

设

计

原

则在探针确定以后再选择引物引物要尽可能地接近探针，但是不要重叠保持G-C含量在30-80%之间避免同一碱基重复过多。特别是G，不可超过4个及以上用Primer

Express软件计算出来的Tm值应当在58-60℃之间3’的5个碱基中G和/或C碱基的总数不能超过2个引物和探针的设计原则的重要程度由上往下越来越低如果是设计SYBR

Green

I引物，也要选择TaqMan

Primer

and

Probe

design并遵守这些规则，但是只需要合成引物就可以了。为了确保引物和探针的特异性，最好将设计好的序列在www.ncbi.nlm.nih/blast中核实一次，如果发现由非特异性互补区，建议重新设计引物探针。如何设计荧光定量PCR实验方案根据仪器和个人的喜好，确定荧光定量PCR的方法，选择荧光素的种类合成引物和探针收集样品、提取RNA或DNA（-80℃保存，避免反复冻融）制备标准品（质粒、化学合成的目的基因）· 拷贝数=质量÷分子量×6.0×1023· 标准曲线通常由4～5个点组成配制好的引物和探针，保存于-20℃，注意避光保存探针RT反应如何设计荧光定量PCR实验方案不加探针的常规PCR反应，验证引物是否合适、模板是否降解、模板纯度是否合适。同时确定最佳反应体系和反应条件每次实验都设置阴性对照和标准品，每个样品设两个平行孔数据分析——基线和阈值的设定√确定正确的基线√设定合适的阈值注意：同样的实验最好使用同样的基线和阈值，这样可以增加实验的准确性、重复性。但是阈值和基线不能被保存，因此必须记录基线的缺省值在3～15循环阈值的缺省值是基线范围内荧光信号强度标准偏差的10倍双击Y轴，将图转化为线图，确定最先出现的反应是否出现在15个循环后，如果是出现在15个循环后，那么不需要调整基线高丰度靶基因经常在PCR循环早期开始扩增需要调整基线的循环终止值先将基线终止循环数定为6，单击Update然后确定第一个检测到扩增的循环数（比第一个检测到扩增的循环数少1或2个循环的数量）将基线终止循环数定为8双击Y轴，将图转化为对数图不正确的基线设置基线终止循环数太低基线终止循环数太高阈值的缺省值是基线荧光信号强度标准偏差的10倍–可以将阈值线的光标移到符合下列条件的扩增曲线的位置：–指数扩增的线性阶段–精度最大–敏感性最大确定最佳阈值标准曲线法斜率的绝对值接近3.322R2接近1