高脂油水平衡培养尖状栅藻的研究

高脂油水平衡培养尖状栅藻的研究

0微藻在废水处理方面的应用能源危机不仅导致依赖化石能源的全球经济发展停滞，而且导致了以争夺原油为目的的全球战争。化石燃料燃烧所排放的废气及其引发的极端气候已经给全人类造成严重的生命危害和巨额的财产损失~。因此,寻求经济、环保的可再生替代燃料是解决石油危机和应对全球气候变化的迫切需求。生物柴油的本质是单烷基脂肪酸酯,与石化柴油相比,其分子内基本不含硫和芳烃,大大降低燃烧排放物中的有毒成分。微藻通过光合作用能够在细胞中积累大量油脂,通常为干重的20%~50%。研究表明,微藻油脂在脂肪酸碳链组成上同其他高等油料植物相似,且微藻藻油中的储藏性油脂主要为三酰甘油(TAG),是生产生物柴油的理想原料。人类生产、生活中所产生的未经处理或稍经处理的工业废水和生活污水排放后,会将过多的营养物质,尤其是氮、磷等携带进入自然水体,引起水体富营养化,造成水质的污染和水体生态环境的严重破坏~。微藻生长过程中能够吸收利用废水中的氮和磷很早就引起了人们的关注,1957年,Oswald提出了利用微藻去除水体中营养盐的观点。半个世纪以来,大量的研究证明,微藻在废水处理,尤其是氮、磷等营养盐去除的可行性。利用微藻处理废水时所产生的生物质可用于生物燃料的生产,该过程能同时满足人类保护环境与开发清洁能源的需求,是一个双赢的过程。本文以一株新近分离的富含油脂淡水绿藻———尖状栅藻(S.acuminatus)为研究材料,比较了其在BG-11培养基中和奶牛场废水中的生长、油脂积累规律和废水中氮、磷去除效率,研究结果可为利用微藻处理废水和生产生物燃料提供理论依据和技术参考。1材料和方法1.1材料表面1.1.1生物技术与生物能源实验室尖状栅藻(Scenedesmusacuminatus)采自暨南大学南湖,由暨南大学水生生物研究所微藻生物技术与生物能源实验室保藏。1.1.2微藻的过滤和培养废水采自河南省新乡市某养殖场。将其沉淀后,用纱布过滤上清液,去除废水中的大颗粒固体及悬浮物后储存于超低温冰箱(-80℃),用于微藻培养。1.1.3主试剂和设备过硫酸钾、硫酸、苯酚、氢氧化钠、蛋白试剂盒、丙酮、甲醇、硫酸、乙醇、乙醚、二甲基亚砜、正己烷、氮气、二氧化碳等。(2)仪器、试验装置高压蒸汽灭菌锅(D-1),超净工作台(SWCJ-1F),恒温震荡培养箱(ZQWY-200G),恒温干燥箱(Binder),高速冷冻离心机(SORVALLbiofuge),冷冻干燥机(VirTiswizard2.0),恒温磁力搅拌器(94-2ThermoFinnigan),氮吹仪(NEVAPTM111),水质化学连续流动分析仪(SEALAA3),透射电镜(Tecnais10)。1.2方法1.2.1bg-11培养基的培养方案利用BG-11培养基(BG-11)将保藏的藻种在三角瓶中扩大培养,待进入指数期后离心去除上清液,分别接入NaNO3初始浓度分别为18.0,9.0,6.0,3.6mmol/L的BG-11培养基中,接种的光密度(OD750)为0.6±0.01,采用Φ3.0cm×60cm的柱状光生物反应器进行培养,温度为(24±1)℃,光照强度约为300μmol/(m2·s)(单侧光照),24h持续光照,通气(含1%CO2的压缩空气)搅拌,培养周期为18d,每组设置3个平行。在培养周期内每天定时取样,测定生物量,绘制生长曲线。1.2.2生长条件的确定利用BG-11培养基(BG-11)将保藏的藻种在三角瓶中进行扩大培养,待进入指数期后离心去除上清液,分别接入浓度为100%,75%,50%和25%的奶牛场废水中,接种的光密度(OD750)为0.6±0.01,采用Φ3.0cm×60cm的柱状光生物反应器进行培养,培养条件同上。1.2.3藻液的干燥、抽滤、冷却将孔径为0.45μm的混合纤维滤膜预先于105℃的烘箱中烘干至恒重(W1),取10ml藻液用烘干的滤膜进行真空抽滤,再置于105℃的烘箱中烘干至恒重(W2),干燥器中冷却至室温后称重。1.2.4总氮和总磷浓度在废水中的测定每天定时取10mL藻液,离心后将上清液进行消解,使用水质化学连续流动分析仪测定整个培养周期内废水中总氮、总磷浓度的动态变化。1.2.5抽提有机溶剂的制备将在培养周期最后一天所采收的藻泥冻干后,按照改进的总脂测定方法测定干藻粉的总脂含量。称取50~100mg冻干藻粉,放置于具螺口瓶盖体积为15mL的玻璃离心管中,再放置一小磁力棒,加入2mL二甲基亚砜-甲醇溶液(V∶V=1∶9),于磁力搅拌水浴锅中40℃恒温水浴1h;后冰浴抽提30min,3500r/min离心5min,转移上清液至一小瓶中。向其余藻渣中加入4mL乙醚-正己烷(V∶V=1∶1)溶液,磁力搅拌冰浴抽提1h,3500r/min离心5min,转移上清液至上述小瓶中,重复上述过程直至藻渣变为灰白色。向上述合并抽提液中加入纯水,使4种抽提有机溶液的体积比例为1∶1∶1∶1,震荡分相,移取有机相至另一小玻璃瓶中,在通风橱中用氮气吹干浓缩,乙醚浓缩液转移至事先称重的1.5mL塑料离心管中,再用氮气吹干至恒重。利用差量法计算干藻粉中总脂的含量。1.2.6gm-spe根据改进后的方法,用硅胶柱(AgelaTechnologoes;Cleanertsilica-SPE;500mg-SPE;500mg)将总脂进一步分离。洗脱顺序:氯仿洗脱中性脂,丙酮和甲醇(V/V=9∶1)洗脱糖脂,甲醇洗脱磷脂,然后将分离的各组分用氮气吹至较小体积后转移至事先称重、体积为1.5mL的塑料离心管中,再次用氮气吹干至恒重,利用差量法计算出磷脂、糖脂及中性脂分别在总脂和干藻粉中的百分含量。1.2.7样品溶液的制备称取25mg冻干藻粉,放置于具螺口瓶盖的体积为15mL的小玻璃瓶中,再放置一小磁力棒,加入2mL含有2%浓度H2SO4的无水甲醇-甲苯(V∶V=9∶1)溶液,同时加入25μL1%的十七烷酸(C17∶0),充氩气后,将离心管放置于磁力搅拌水浴锅中,80℃恒温水浴1.5h;然后分别加入1mL的纯水和正己烷,震荡后以3000r/min离心5min,将上层有机相转移至另一小玻璃瓶中,用氮气吹干,再加入100μL正己烷密封,留存上样。利用气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术进行分析。1.2.8计算公共格式总脂单位体积含量:V=ρ×ω式中:ρ为干藻粉的生物量,g/L;ω为干藻粉的总脂含量,%;T为培养时间,d。2结果与讨论2.1不同浓度奶牛场废水中的生长特性图1为在柱状光生物反应器中,不同NaNO3初始浓度的BG-11培养基与不同浓度奶牛场废水培养下尖状栅藻的生长曲线。由图1(a)可知,在BG-11培养组中,尖状栅藻的生长经历了一个短暂的延滞期后进入指数生长期,从培养的第3天开始,生物量开始随着NaNO3初始浓度的不同而有所差异,然后缓慢进入平台期。第18天,尖状栅藻在NaNO3初始浓度为6.0mmol/L的BG-1培养基中取得最高的生物量,为9.5g/L。由图1(b)可知,尖状栅藻在接入奶牛场废水后并没有出现短暂的延滞,说明奶牛场废水可能适宜其生长,无需经过短暂的适应直接进入对数生长期。在培养周期的前6d,尖状栅藻在4个浓度奶牛场废水中的生长并未有明显的差异,说明此时4个浓度奶牛场废水中营养物质含量相对尖状栅藻的生长需求均充足;从第7天开始,4条生长曲线开始出现差异,且随着奶牛场废水初始浓度的降低,生物量有降低的趋势;从第16天开始,尖状栅藻的生长进入平台期,此时100%奶牛场废水培养组获得最高的生物量,达到12.2g/L。比较两个试验组的生长可明显看出,尖状栅藻在NaNO3初始浓度为6.0mmol/L的BG-11培养组中取得最高的生物量9.5g/L,几乎与25%废水组的最高生物量相持平,而在100%废水培养组获得的最高生物量达到12.2g/L,明显高于BG-11培养组。以上结果表明,尖状栅藻对含有高浓度氮、磷的废水具有较高的耐受性,此外,该藻能在色度大、有机物含量高的奶牛场废水中获得比人工培养基培养条件下更高的生物量,说明在透光度较低的奶牛场废水中该藻的代谢方式发生了转变,由光合自养转化为异养或混养的营养方式。2.2总氮和总磷的去除经测定可知,原废水中的总氮浓度为43.4mmol/L,约为BG-11培养基中总氮浓度(18.0mmol/L)的2.4倍。从图2中可知,尖状栅藻在培养的过程中,4个浓度废水的总氮含量在第1天均有一个急剧的下降。25%废水组在培养的第5天,总氮浓度即降至1.4mmol/L,去除率高达93.2%。50%,75%,100%废水组中总氮含量自培养的第6天开始趋于一个相对稳定的状态,其中100%废水组在第7天时,总氮浓度降至5.9mmol/L,去除率约为86.4%。原废水中总磷的浓度为2123.6μmol/L,约为BG-11培养基总磷浓度(229.9μmol/L)的9.3倍,在尖状栅藻培养的过程中,4个浓度废水的总磷含量在第1天均急剧下降,在第3天时趋于一致,均保持在13.1μmol/L,总磷的去除率达99.4%。由以上结果可知,尖状栅藻在短期内对奶牛场废水中总氮、总磷的去除效果明显,是适用于奶牛场废水处理的良好藻株。2.3初始氮浓度对尖状栅藻总脂含量的影响微藻细胞的有机物主要由蛋白质、碳水化合物和脂质组成,图3反映了4个不同NaNO3浓度的BG-11培养基与4个不同浓度废水培养条件下尖状栅藻的生化组成情况。由图可知,尖状栅藻的脂质含量最高,其次是碳水化合物和蛋白质。图3(a)与图3(b)均反映了相同的变化趋势:随着初始氮浓度的降低,尖状栅藻细胞中蛋白质和碳水化合物的含量降低,总脂含量升高。图3(a)中,NaNO3初始浓度为18.0mmol/L培养组藻总脂含量约占干重的49.4%,3.6mmol/L培养组时总脂含量约占干重的62.6%;图3(b)中,100%的废水组总脂含量约占干重的36.8%,25%的废水组总脂含量约占干重的62.4%。由图3可知,BG-11培养组尖状栅藻总脂含量普遍比废水培养组总脂含量高。研究表明,氮限制所构成的外界环境胁迫是一个高效促进油脂积累的方法。在两种不同培养条件下,随着培养时间的延续,培养基中总氮、总磷等营养物质含量均降低,尤其是在初始氮浓度较低的培养组,氮营养盐缺乏成为尖状栅藻生长的限制因素,因此初始氮浓度最低的培养组中总脂含量较高。废水中氮含量普遍比BG-11培养基中的高,因此废水组尖状栅藻总脂含量比BG-11培养组低。2.4废水浓度及培养基组分的影响图4总脂分级结果表明,中性脂是尖状栅藻总脂的主要组成成分(占总脂含量的60%以上),糖脂次之,磷脂最少。随着废水浓度的降低,中性脂占总脂的比例升高,糖脂和磷脂降低。废水浓度由100%~25%,总脂的含量由干重的36.8%上升至62.4%,中性脂占总脂比例由65.4%上升至87.1%。随着废水浓度的降低,培养基中氮含量也随之降低,可能引起微藻细胞代谢途径发生转变,细胞中类囊体膜的含量降低,酰基水解酶的活性增强并刺激磷酸水解。以上这些变化促使细胞内的脂肪酸乙酰辅-CoA含量增加,与此同时,氮含量的降低也将促进二酰基甘油酰基转移酶将脂肪酸乙酰辅-CoA转化成三酰甘油(TAG),因此,氮含量的降低促使尖状栅藻细胞内总脂和中性脂含量同步升高。2.5脂肪酸组成中a对废水培养所得尖状栅藻藻粉进行脂肪酸组成(图5)分析可知,尖状栅藻共由3种碳链长度的11种脂肪酸组成,其中多为不饱和脂肪酸,油酸(C18∶1)、棕榈酸(C16∶0)所占比例较高,其次为亚麻酸(C18∶3)、亚油酸(C18∶2)和棕榈油酸(C161)。石化柴油中的烷烃主要由15个左右碳原子组成,尖状栅藻藻油中的脂肪酸碳链长度与石化柴油平均碳链长度相近,是生产生物柴油的理想原料。2.6总脂含量的测定微藻的产油性能不仅与微藻油脂含量相关,也与该藻生物量相关,因此,在此引入总脂单位体积含量对微藻的产油性能进行评价。由图6可知,尖状栅藻在BG-11与废水培养组,单位体积藻液的总脂含量均超过4.0g/L,说明尖状栅藻是一株极具潜力的产油微藻。NaNO3初始浓度为3.6mmol/L的BG-11培养组的尖状栅藻总脂单位体积含量达到5.3g/L,与同类研究的数据相比优势明显。在50%与25%废水培养组中,该藻单位体积藻液的总脂含量分别达到5.7g/L与5.9g/L,均高于BG-11培养组的最高值。以上结果说明,尖状栅藻是一株极具潜力的产油绿藻,且在废水培养条件下其产油性能比在人工培养条件下更具优势。2.7总脂单位体积产率总脂单位体积产率与微藻总脂含量、生物量和培养时间相关