糖尿病小鼠心肌microrna的表达及差异靶基因的生物信息学分析

糖尿病小鼠心肌microrna的表达及差异靶基因的生物信息学分析

糖尿病性心肌病（cd）是糖尿病慢性并发症中的一种特征性心肌病变。研究［１－３］发现,microRNA(miRNA)在心血管疾病中发挥重要作用。本研究采用STZ诱导T1DM小鼠建立模型,运用基因芯片技术检测心肌组织中差异miRNA表达,旨在探讨miRNA在DC中的作用。材料和方法一、材料和模型的制备1.主要试剂与仪器:STZ、TRIzol试剂(Sig-ma);miRNA分离试剂盒(miRNeasyminiKit,Am-bion);HE染液(BASO公司);基因芯片采用RT２miRNAPCRArrays(Qiagen);OneTouchⅡ血糖仪(强生);SpectrophotometerND-2000(NanoDrop);实时定量PCR仪(ABI7900HT);微量移液器(Ep-pendorf);BX51系统显微镜(Olympus);2100生物分析仪(Agilent)。2.分组及模型建立:8周龄雄性C57BL/6小鼠12只,由美国查尔斯河动物中心提供,体重23~25g,采用随机数字表法分为模型组和对照组,每组6只。模型组予单次腹腔注射150mg/kgSTZ制备T1DM动物模型,对照组予单次腹腔注射等量枸橼酸钠溶液。48h后尾静脉检测血糖,血糖>16.7mmol/L小鼠即为造模成功。成模6周后处死小鼠,取心肌组织置于-80℃备用。二、pcr和基因表达检测1.心肌组织学检查:取左心室心肌组织,采用10%PBS中性甲醛固定液固定,经脱水、清洗、石蜡包埋后制成切片,HE染色后采用光学显微镜观察心肌细胞形态学改变。2.心肌组织总RNA提取及质量鉴定:按照TR-Izol试剂说明书步骤逐步提取各组心肌组织总RNA,采用miRNeasyMiniKit进行纯化,获得miRNA。采用NanoDrop2000测定总RNA/miRNA吸光度A260和A280值,根据A260值计算其浓度,计算A260/A280以检测其纯度。采用2100生物分析仪进一步检测总RNA/miRNA质量。3.定量聚合酶链反应(qPCR)检测心肌组织B型尿钠肽(BNP)和组蛋白去乙酰化酶1(Hadc1)mRNA表达:取2μgmRNA逆转录为cDNA,PCR体系20μl,其中SYBRGreen10μl,上游(10μmol/L)、下游引物(10μmol/L)各1μl,cDNA1μl,ddH２O7μl。PCR扩增参数为95℃预变性10min,95℃变性15s,60℃退火1min,扩增40个循环。扩增引物序列BNP上游5′-CTGCTAGACCACCTGGAGGA-3′,下游5′-AAGCTGTTGCAGCCTAGTCC-3′,扩增片段320bp;Hdac1上游5′-AGTGTGTGGAGTTCGTGAAG-3′,下游5′-CTCATTAGGGATCTCTGTGTC-3′,扩增片段135bp;内参基因Rps16上游5′-AAGTCTTCGGACGCAAGAAA-3′,下游5′-TT-GCCCAGAAGCAGAACAG-3′,扩增片段148bp。每个标本进行2个复管检测。4.miRNA表达检测:利用RT２miRNAPCRArraysMouseMifinder快速分析通路聚焦的miRNA分析板(96孔板),利用基于SYBR?Green的实时定量PCR,实现敏感且特异的miRN检测和表达谱分析。每个样本重复3次。(1)cDNA合成。根据总miRNA测定浓度,每个样品取总miRNA100ng,使用RT２EasyFirstStrandKit合成cD-NA,反应体系10μl,即1μlmiRNARTPrimer&ERCMix,2μl5×miRNARTBuffer,1μlmiRNARTEnzymeMix,1μlmiRNANucleotideMix,5μlRNase-freeH２O。反应程序为37℃孵育2h,95℃5min,冰浴10min,RNase-freeH２O10倍稀释。置于-20℃或直接用于下一步实验。(2)miRNA检测。再将cDNA模板100μl与2×RT２SYBRGreenqPCRMasterMix1275μl,ddH２O补充至2550μl。将等体积混合液分配至96孔板中,反应体系25μl。使用ABI7900HTPCR仪器运行。反应程序为95℃预变性10min,95℃变性15s,60℃退火1min,72℃延伸30s,扩增40个循环。(3)miRNA差异表达分析。利用ABIPRISM7700SequenceDetectionSystem导出原始CT值上传至Qiagen公司提供的在线数据分析软件快速分析数据,筛选出差异表达的miRNA。5.差异miRNA靶基因预测及功能分析:采用生物信息学分析方法,利用TargetScan、PicTar和miRanda分析软件预测并分析异常表达miRNA的靶基因以及分析其功能。三、统计方法采用GraphPad5.0软件进行统计学分析。计量资料以x珚±s表示,样本间比较采用t检验。一、两组之间的体重、心体重和血糖值的比较成模6周后,模型组体重、心脏重量和血糖水平与对照组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。二、两组心肌组织qpcr检测组织学观察显示,模型组心肌横切面可见心肌细胞增大,排列紊乱,细胞核增大且深染(图1A),对照组心肌纤维排列整齐,分布较均匀(图1B)。心肌组织qPCR显示,与对照组相比,模型组心肌肥大分子BNP升高,Hdac1降低(P<0.05)(图2)。提示糖尿病小鼠处理6周,其心肌细胞开始肥大,心肌组织已损伤,即DC模型建立成功。三、总rna质量测量方法NanoDrop2000测定总RNA浓度(260nm),A260/280值1.8~2.0,A260/230>1.8,说明核酸纯度较高(比值未列出)。采用2100生物分析仪测定总RNA完整性发现,RNA/miRNA无降解,质量可靠(图3)。提示两组心肌组织标本总RNA/miRNA质量均较好,可满足后续miRNA芯片检测和实时定量PCR要求。四、mir-19a、mir-32b、mir-341e的表达基因芯片检测结果显示,与对照组相比,模型组心肌组织中13个miRNA存在不同程度改变,其中miR-19a、miR-19b、miR-22、miR-503、miR-467e表达上调,miR-1、miR-29a、miR-30a、miR-96、miR-101a、miR-142-3p、miR-199-5p、miR-374表达下调。五、mirna检测表现对差异miRNA调控的主要靶基因进行预测,其生物学功能主要涉及细胞增殖、凋亡和分化、炎症反应及胶原形成密切相关。表达上调的miRNA及其靶基因包括(1)miR-19a:TNF-α炎症应答、细胞凋亡;GJA1心脏发育、细胞周期;CCND1细胞周期、细胞增殖。(2)miR-19b:NR1C1心脏发育、炎症反应;PDK4糖代谢调节。(3)miR-22:PTEN细胞周期;FGF3心脏发育、细胞增殖、细胞黏附;SRF转录调控;VCAM1免疫调节、炎症应答、细胞黏附。(4)miR-503:GA-TA4心肌细胞增殖与分化;BCL-2细胞凋亡;CDC25A细胞增殖;CCNE1细胞周期;VEGFA血管生成、细胞增殖。(5)miR-467e:IGF1R细胞增殖;TIMP3细胞外基质重塑。表达下调的miRNA及其靶基因包括(1)miR-1:IGF1细胞增殖;G6PD糖代谢;MTPN心肌肥大;TSP1细胞外基质重塑;RASA1血管生成、细胞黏附;ET-1细胞凋亡。(2)miR-29a:TGFB3细胞生长、细胞增殖;HDAC1转录调控;CCNA2细胞周期;PDGFRA调节成纤维细胞增殖;COL1A1胶原纤维形成、细胞黏附;COL3A1胶原纤维形成、细胞基质黏附。(3)miR-30a:MEF2C转录调控;NFKBIA细胞凋亡、细胞增殖;BECLIN-1细胞周期、细胞增殖;SNAI1细胞凋亡;LHX1转录调控。(4)miR-96:RAC1细胞骨架重组、细胞黏附。(5)miR-101a:GJA1心脏发育、细胞周期;c-FOS炎症反应;COX-2细胞增殖、细胞周期、炎症反应。(6)miR-142-3p:RAC1细胞骨架重组、细胞黏附;ROCK2肌动蛋白细胞骨架、细胞质移动;APC细胞凋亡、细胞黏附;MYH9血管生成、细胞黏附。(7)miR-199-5p:CDC14A细胞增殖;FN1血管生成、细胞黏附。(8)miR-374:FGF7心脏发育、细胞增殖、细胞黏附。本研究采用实时定量PCR仪,将PCR高扩增效率、高敏感性和高特异性引入miRNA检测中。在检测的88个miRNA中,与对照组比较,模型组心肌组织中13个miRNA存在不同程度改变。这些miRNA中,miR-1、miR-22和miR-503在心脏疾病的病理过程中有重要的调节作用。研究［４］发现,表达miR-1可降低心肌细胞大小及心肌肥大细胞的分子标记,推测miR-1在心肌细胞肥大和心肌纤维化中有重要作用。研究还表明,DC发病过程中可能是由miR-1/206通过调控IGF-1起作用,但具体机制还有待研究［５］。miR-22是另一种与心肌肥大和纤维化相关的miRNA。研究［６］发现,在苯肾上腺素或ATⅡ诱导的大鼠心肌细胞中,miR-22上调可引起心肌细胞肥大及Myh表达下调,而通过抑制靶蛋白PTEN下调miR-22表达从而有效防止大鼠心肌细胞肥大。另有研究［７］发现,miR-30家族在小鼠肥厚性心脏和患者心脏中上调。研究［８］报道,长期慢性饮酒导致小鼠心脏肥大,miR-30a下调。miR-30有可能成为诊断左心室肥大的重要分子标记［９］。近来研究［１０］发现,miR-101a/b在大鼠心肌梗死组织中下调,在ATⅡ作用下,新生大鼠心脏成纤维细胞中亦下调。目前尚无miR-467e、miR-96、miR-142-3p、miR-199-5p和miR-374与心脏疾病的相关报道,其生物学特征和功能还有待研究。差异表达的miRNA可能调控的靶基