川芎提取物对糖尿病大鼠糖尿病血糖的影响

川芎提取物对糖尿病大鼠糖尿病血糖的影响

关于川药的药理学研究，赛格等人报告了川药提取物对大鼠血脂的影响。对于四川提取物的研究，赛格等人认为它可以抑制苯并（h）和细胞内的dna结合。这些研究结果表明，川药虽然能改善糖尿病患者的手足坏死和发病率，但关于川药降血糖作用的文献很少。所以笔者试图探讨川芎提取物对血糖的影响以及作用机制,报道如下。1材料表面1.1实验动物1.2其他催化剂和酶血糖(Bio-BasicINS公司,加拿大),葡萄糖氧化酶/过氧化物酶试剂(Sigma公司,美国),125I-胰岛素试剂盒(Shibayaki,涩川,日本),ED-TA(Sigma公司,美国),β-巯基乙醇(Sigma公司,美国),ATP(Sigma公司,美国),NADP+(Sigma公司,美国),葡萄糖-6磷酸脱氢酶(Sigma公司,美国),组氨酸(Sigma公司,美国),葡萄糖-6磷酸(Sigma公司,美国),6-磷酸葡萄糖脱氢酶(Sigma公司,美国),柠檬酸钠(Junsei公司,日本),乙酰辅酶A(Sigma公司,美国)。1.3生命质量与仪器旋转式真空蒸发器EyelaN-1000(东京,日本),紫外/可见分光光度计ThermoGenesys10UV(Waltham,美国),恒温培养振荡器生命科学SH-802F(BucheonKorea),γ光谱仪NationalSecurityTechnologiesCanberraHPGe公司(普拉特维尔,美国),高速真空浓缩机JouanRC10-22(巴黎,法国),电热套MS-E107(首尔,韩国)。1.4加热时间的确定川芎购自锦山药材市场(产于韩国庆北道安东),提取溶液是H2O、50%EtOH和100%EtOH。用H2O提取时,在容积10L圆底烧杯中放入1kg川芎,7L的蒸馏水,放入冷凝管,在100℃电热套中加热5h,重复3次。50%EtOH和100%EtOH提取液在10L圆底烧杯中放入1kg川芎,加入7L的50%EtOH或100%EtOH,以上同样方法加热5h,重复3次。合并提取液用滤纸过滤。减压浓缩机45℃浓缩,用高速真空浓缩机浓缩后得到干燥粉末,备用。2测试方法2.1实验动物的制备按照Kim&Kang法进行血糖动物繁殖及测试。1周性情稳定后,选择250~300g大鼠,5只为一组,分别为:正常组(正常组)、链脲佐菌素糖尿病大鼠组(STZ组)、链脲佐菌素糖尿病大鼠50%EtOH提取液组(STZ+50%EtOH组)、链脲佐菌素糖尿病大鼠100%EtOH提取液组(STZ+100%EtOH组)、链脲佐菌素糖尿病大鼠水提取液组(STZ+H2O组)。糖尿病大鼠模型制作:5ml柠檬酸缓冲液(pH值4.5)溶液,按照50mg/kg链脲佐菌素的标准制作注射液,进行腹腔注射,破坏胰腺的β细胞,以此来诱发2型糖尿病。饲育6d,绝食16h后,从尾静脉抽血进行血糖检查,血糖值在240mg/dl以上的大鼠选为实验动物。正常组用5ml的柠檬酸缓冲液(pH值4.5)注射,相同方法检测,血糖值范围在60~70mg/dl的大鼠选为实验动物。STZ+50%EtOH组,STZ+100%EtOH组和STZ+H2O组,STZ组注射7d后,川芎提取物粉末1g/L用H2O溶解,用导管口腔灌胃日每天1次,饲育3周。正常组和STZ组用同体积相同的方法灌胃3周饲育。饲育室温度为20~25℃,湿度为50%~60%,灯光照射间隔12h。2.2羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液法节食16h后,取血液以3000r/min、4℃离心15min,从血液中提取葡萄糖和胰岛素测定。注射0.9%(W/V)的NaCl溶液清除血液,摘取肝脏,用刀片切碎,组织碾磨器进行组织破碎,使用100mmol/L三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液,5mmol/L乙二胺四乙酸,10mmol/Lβ-巯基乙醇含有的150mmol/LKCl溶液(pH值7.4)20%(W/V)取组织破碎液,组织破碎液10000g离心15min分离细胞核和线粒体,采取上清液用来作为酶原。2.3观察指标2.3.1葡萄糖标准溶液的配制葡萄糖氧化酶和过氧化物酶利用酶反应生成的酸化性邻联茴香胺的吸光度425nm的测定定量,葡萄糖标准溶液浓度为25%、50%、100%、150%;利用葡萄糖溶液,血清是同样体积的10%(W/V)TCA处理后,去除变形蛋白质沉淀物,定量上层液。2.3.2小鼠血清中放线菌pa根据Kim&Kang(2009)方法,测定血清胰岛素浓度。利用125I-insulinkit进行放射免疫分析实验,在试验管放入血清样品0.2ml和胰岛素抗体0.2ml胰岛素-125I,在37℃放置1h,加入二抗0.1ml混合,常温放置1h反应后,2500r/min离心15min,得到沉淀物,用γ计数器测定放射性。用2.5~100μLTU/ml胰岛素标准溶液做出标准曲线,所有的实验反复3次,分别计算胰岛素的浓度。2.3.4nadph的制备葡萄糖激酶反应的生成物葡萄糖6磷酸盐以葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酸化形成NADPH340nm吸光度测定,酶的反应液的造成(最终浓度)50mmol/L三羟甲基氨基甲烷/盐酸缓冲液(pH值7.5),100mmol/L葡萄糖液,5mmol/LMgCl2,5mmol/LATP,0.1mmol/LNADP,0.2U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的整体活性是50mmol/L磷酸缓冲液(pH值7.6),10mmol/LMgCl2,1mmol/LNADP+,酶原,5mmol/L葡萄糖6磷酸盐,5mmol/L6-磷酸组成的1ml反应液,在透光1cm的吸收池中放入反应生成NADPH,25℃340nm测定吸光度增加值。6-磷酸葡萄糖脱氢酶的活性50mmol/L钾磷酸盐缓冲液(pH值7.6),10mmol/LMgCl2,1mmol/LNADP+,酶原,5mmol/L,5mmol/L6-磷酸组成的1ml的反应液,用葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的整体活性测定结果同样的方法来测定。葡萄糖-6-磷酸脱氢酶酶活性是两酶全体活性和6-磷酸葡萄糖脱氢酶的酶活性之差。为了测定肝乙酰辅酶A羧化酶活性测定,把50mmol/L三羟甲基氨基甲烷/盐酸(pH值7.5)、10mmol/L柠檬酸钠、10mmol/LMgCl2、0.5mg/mlBSA、3.75mmol/L谷胱甘肽、3.75mmol/LATP、0.125mmol/L乙酰辅酶A、12.5mmol/L用(同位素14C标记)碳酸氢钠组成的溶液加入酶原37℃下反应10min,加入5mmol/LHCl0.2ml终止反应。以上的溶液在5000r/min离心5min分离,把上层液移到闪烁计数瓶后,85℃干燥60min,用1ml蒸馏水溶解加入混合液(聚苯醚10g,1,4-双[2-(5-苯基)恶唑基]苯0.25g,谷胱甘肽100g,二氧杂环乙烷1L)10ml,用Tri-Carb液体闪烁计数器放射能乙酰辅酶A转移14CO2和产生的丙二酰辅酶A定量,测定肝乙酰辅酶A羧化酶活性的增量。2.3.5检测数值测定用student’stest和Duncan’smultiplerangtest软件,测定数值用均数±标准差表示,用t检验检测数值。3结果3.1影响糖浓度的影响用STZ破坏了胰脏的β-细胞再生胰岛素生成,测定血清胰岛素的浓度,结果见表2。3.2影响肝脏酶活性3.2.1影响肝脏葡萄糖激酶和肝乙酰酶a羧化酶活性3.2.2磷酸戊糖的合成途径消耗葡萄糖的代谢除了无氧代谢EMP(glycolysis)的途径以外还有HMPshunt(磷酸戊糖途径)的途径,是核苷酸的合成的必要戊糖生成和分解的途径。为了了解川芎提取物对HMPshun代谢的活性,摘除给药老鼠的肝脏,测定葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性。见表4。4不同有机溶剂提取的糖尿病大鼠葡萄糖激酶活性的变化在以往研究中,当归的50%EtOH提取物降血糖的效果是64%,比熟地黄50%EtOH提取物67%略低,最好的提取溶液是100%乙醇,50%乙醇提取物降血糖作用当归效果是最显著的。在表1中可以看出川芎乙醇提取物都有降血糖作用,但是水提取物没有降血糖作用。在表2中,川芎提取物对破坏的β-细胞再生没有影响,反而妨碍胰岛素的生成。在表1中看出川芎提取物的降血糖效果不是影响胰岛素而产生的,Kim&Kang黑人参提取物、Yuan红参提取物STZ诱发糖尿病诱发大鼠能降血糖,可是黑人参提取物和红参提取物对胰岛素增加没有关系,根据这个结果,提出黑人参和红参的效果是增大胰岛素敏感性和与糖代谢关联酶活性。本研究推测川芎的乙醇提取物的降血糖作用像红参和黑参一样,通过增大胰岛素敏感性和与糖代谢关联酶活性实现的。在表3中,糖尿病大鼠的葡萄糖激酶在给予100%EtOH提取物和水提取物后活性没有恢复,给50%EtOH提取物和水提取物后活性恢复是微量的,川芎提取物没有改善葡萄糖激酶活性的作用。在表4中,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活性,正常组是400unit/mg,STZ组为51unit/mg,是正常组的13%。EtOH提取液的糖尿病大鼠中,STZ+50%EtOH组是154unit/mg,STZ+100%EtOH组是182unit/mg,STZ+H2O组是131unit/mg,这个结果比糖尿病大鼠数值上升了2.6~3.6倍,相当于正常大鼠的33~46%(P<0.01),在所有川芎提取液中,葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活性都增大了,其中100%EtOH的活性增大的效果最好。同时,6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性在正常组是40unit/mg,STZ组是5unit/mg,是正常组的13%。EtOH提取液中,STZ+50%EtOH组是79unit/mg,STZ+100%EtOH组是64unit/mg,STZ+H2O组是20unit/mg,分别是糖尿病大鼠的16倍、13倍和4倍。但在STZ+H2O组中没有效果,只在STZ+50%EtOH组和STZ+100%EtOH组中有效果(P<0.01)。STZ+50%EtOH组和STZ+100%EtOH组6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性比正常大鼠活性提高了1.6~2倍。糖尿病大鼠葡萄糖-6-磷酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性恢复,说明川芎的乙醇提取液有效,特别是100%EtOH提取物对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶效果最好,50%EtOH提取物对6-磷酸葡萄糖脱氢酶效果最好,水提取物是没有效果的。在表5中乙酰辅酶A羧化酶的活性正常组是0.3nmol/min,STZ组是0.17nmol/min,糖尿病大鼠的活性是正常大鼠活性的57%。给予川芎提取物的糖尿病大鼠中,STZ+50%EtOH组,STZ+100%E