基于气相色谱-质谱联用技术分析型糖尿病大鼠尿液代谢组学变化

基于气相色谱-质谱联用技术分析型糖尿病大鼠尿液代谢组学变化

糖尿病（ii类）是一种常见的全身内侧疾病，主要以慢性高血糖、胰岛素不足和酮症为临床特征。通常表现为整体性的代谢紊乱,也称“代谢综合症”。糖尿病很难用单一的评价指标和发病机制来反应其发生及变化。“定量测定病理生理刺激或基因改变情况下生物系统的动态多参数代谢物变化”是代谢组学(Metabonomics)的定义,它是一项动态的、多参数应答的新技术,反映的是基因、环境、致病因素、营养、药物、时间等诸多因素综合作用于机体后的总反应,而代谢物组是判定健康、疾病和治疗效果合适的分子集合。因此运用代谢组学技术研究Ⅱ型糖尿病,通过考察完整生物体致病后其代谢产物的变化,进行生物体代谢状态研究,对糖尿病的研究有着重要意义。本实验基于气相色谱-质谱联用技术分析Ⅱ型糖尿病大鼠模型尿液代谢谱的变化,探索Ⅱ型糖尿病的代谢组学特征及与其密切相关的小分子生物代谢产物,为Ⅱ型糖尿病病机研究提供一种新思路。1材料和方法1.1实验动物1.2试剂和机器1.3实验方法1.3.1动物组和模型1.3.2生化指标的检测1.3.3收集和检测尿液样品1.3.4化合物特性的测定代谢组学数据处理:原始GC-MS数据文件,通过本实验室自定义的MATLAB脚本进行基线矫正、峰判别和匹配、内标和系统杂峰的排除和峰的归一化等计算过程。最终得到包括化合物的特性指标(这里用质核比来表示),样本名以及归一化后的峰面积三者在内的数据集。将上述数据集导入到SIMCA-P12.0软件包(Umetrics,Ume,Sweden)采用主成分分析(PCA)与正交偏最小方差判别分析的方法(OPLS-DA)进行分析。2结果2.1生化指标的检测结果2.2关于排尿代谢谱变化的研究2.2.1大鼠尿样的代谢模式及分布为了更直观地展示正常对照组大鼠在喂养过程中及模型对照组大鼠在造模过程中的代谢模式变化,本实验分别将各个阶段的正常对照组大鼠和模型对照组大鼠的尿液代谢谱进行比较,结果表明,正常大鼠代谢轮廓除了第9周的尿液样本与其他几周的尿液样本分离程度相对比较清晰,其余各个时间的样本没有明显的分离现象,但是从总体趋势上看,正常组大鼠在喂养过程中,随着时间的推移,大鼠尿样的代谢模式有一个在一维上向左移动的趋势,见图3。与正常大鼠代谢模式随时间推移的变化趋势图相比,模型对照组大鼠代谢谱随时间推移所呈现的变化程度更加明显。第0-4周代谢谱之间交叉重叠程度较高,主要落在第Ⅰ和第Ⅳ象限,第5周开始,即注射STZ之后1周,各周样本集之间分离趋势愈加明显,可以清晰的看到,5、6、7周其尿液样本主要分布在第Ⅱ象限,8、9周大鼠尿液样本主要分布在第Ⅲ象限,随着时间推移,偏离正常状态的现象十分明显,见图4。说明在造模过程中,大鼠的正常代谢逐渐发生紊乱,并且越后期代谢紊乱现象越明显。2.2.2尿样代谢产物的变化本实验选择病理变化程度最大的第9周的样品进行PLS-DA的代谢模式比较,分析55个个体差异代谢物,并对其相对浓度进行t检验,最终鉴定了其中14个代谢物,结果表明,与正常对照组大鼠比较,模型对照组大鼠尿样中戊二酸、苯丙酸、3,4-对羟基丁酸、9,12-十八碳烯酸、2,3,4-三羟基丁酸、苏氨酸、丙氨酸含量明显上升(P<0.05或P<0.01),柠檬酸、脯氨酸、N-苯乙酰甘氨酸、苯乙酸、壬二酸、己二酸、琥珀酸含量显著下降(P<0.05或P<0.01),最终鉴定结果及14个代谢产物在模型对照组与正常对照组之间的含量具体变化情况,见表3。3产物的代谢产物及动力学信息代谢组学研究一般检测的是大量生物样品中分子量在1000以下的小分子化合物的组成,较常用的生物样品包括:血样、尿样、组织液等生物体液。生物体液中的代谢物与细胞和组织中的代谢物处于动态平衡,生物体中细胞功能异常将导致生物体液成分的变化。所有由生理病理紊乱引起的直接化学反应,通过控制代谢的酶或核酸相结合而引起的内源生化物质在比例、浓度及代谢通量等方面的失调都会在代谢成分中得到反映。因此,从生物体液中代谢物的角度研究Ⅱ型糖尿病这种代谢紊乱性疾病是一个很好的渠道。尿液作为生物样品的一种,获取方法简单,对生物体损伤小,小分子代谢产物种类繁多,信息量大,在代谢组学研究中较常使用。实验结果表明,模型组大鼠尿液代谢谱随着时间的推移逐渐发生偏离,而正常对照组大鼠尿液代谢谱随时间推移虽然有偏离,但只在一维上向左偏移,偏离程度不显著,表明在Ⅱ型糖尿病形成过程中及病变程度加深过程中,大鼠的代谢逐步偏离正常。另外组内各个样本点较分散,说明各样本大鼠之间存在个体差异,可能是并发症及其他因素干扰造成的。同时利用OPLS-DA中变量权重参数筛选出差异代谢产物共55个,经NIST05谱库鉴定了其中14种代谢物,其中三羧酸循环代谢产物柠檬酸、琥珀酸含量降低,氨基酸类物质如脯氨酸、苏氨酸、丙氨酸含量显著上升。这与糖尿病病理状况相符,胰岛素不足时,一些酶活性减弱,使三羧酸循环减弱;并且蛋白质代谢紊乱,肌肉及肝中蛋白质合成减少而分解增多,血浆及尿液中氨基酸增多。同时本实验中发现了β-羟丁酸的前体物质3,4-二羟基丁酸、2,3,4-三羟基丁酸,β-羟丁酸是体内酮体的最主要的组分且酸性最强,常被临床选为发现潜在性致命性糖尿病酮症酸中毒的可靠指标,这对糖尿病酮症的早期治疗极其重要,这与之前研究相一致。本实验还检测到一些含有苯环的化合物,例如,苯乙酸、苯丙酸、N-苯乙酰甘氨等,含有苯基的化合物是由肠道内菌群代谢产生的,代谢的母体主要是食物中的多酚和食物蛋白质分别出来的一些芳香族的氨基酸,如苯丙氨酸、酪氨酸等。II型糖尿病大鼠中随尿液排出的苯乙酸、苯丙酸、N-苯乙酰甘氨等代谢产物含量较正常大鼠发生显著性变化,在一定程度上表明II型糖尿病大鼠体内的肠道菌群代谢发生紊乱。另外,在本实验研究中,还发现了一些有机酸,如壬二酸、己二酸等,目前虽无相关文献表明其与糖尿病有关,但其含量变化表明其对糖尿病的相关代谢产生了影响,其所含有的生物学信息有待进步一研究。清洁级雄性(SD)大鼠27只,体重180-200g(上海斯莱克实验动物有限公司),生产许可证:SCXK(沪)2007-0005。链脲佐菌素(STZ),Sigma公司,生产批号:S0130;盐酸甲氧胺(CH5NO·HCL)美国Sigma公司,生产批号:GA10827;MSTFA含1%TMCS,美国Sigma公司,生产批号:BCBB0780;吡啶(Pyridine),分析纯,成都市科龙化工试剂厂,生产批号:20091103;正庚烷(C7H16),色谱纯,Fluka公司,生产批号:904025;人胰岛素放射免疫试剂盒(HumanI125-INSRIAKit),北京福瑞生物工程有限公司,生产批号:20111020028;大鼠血糖(GLU)测试盒,上海中能德赛技术诊断有限公司,生产批号:25043/952005/2;大鼠甘油三酯(TG)测试盒,上海中能德赛技术诊断有限公司,生产批号:57152/975006/2;大鼠总胆固醇(CHO)测试盒,上海中能德赛技术诊断有限公司,生产批号:13045/931006/2;罗氏活力型血糖仪,型号:CR2032,罗氏诊断产品(上海)有限公司;气相色谱-质谱联用仪,型号:GCMS-QP2010,日本岛津公司;Agilent色谱工作站,日本岛津公司;毛细管柱(0.25mm×30m×0.25μm),型号:ZB-5MS,Agilent;自动放免仪,型号:SN682,中国科大中佳公司;全自动生化分析仪型号:7020,日本日立株式会所。健康雄性SD大鼠,随机分成正常对照组(NC组)10只,Ⅱ型糖尿病模型组(T2DM组)17只。实验前测定体重、血糖。NC组以普通饲料喂养,T2DM组以高脂饲料(基础饲料69.5%,蔗糖10%,蛋黄10%,胆固醇0.5%)喂养,4周后,禁食16h,模型组参照文献,并结合本课题前期实验结果,以30mg·kg-1单次小剂量腹腔注射1%STZ(用前以pH4.2的0.1mol·L-1柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液新鲜配制),之后继续以高脂饲料喂养直至实验结束。NC组注射等剂量的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液作为对照。1周后尾静脉采血测定空腹血糖,以空腹血糖大于11.1mmol·L-1确定为糖尿病成模型大鼠,成模14只。分别于造模成功后每周末即6~9周末禁食12h,尾静脉采血测定空腹血糖。第9周周末眼眶取血,分离血清,按照TG、CHO检测指标作业指导书及卫生部《全国临床检验规程》对大鼠血清TG、CHO进行检测;按照胰岛素放免试剂盒操作说明书放射免疫法测定大鼠血清FINS。于0~9周末用大鼠代谢笼收集大鼠尿液样本,离心去沉渣,取上清液,加1%叠氮化钠(NaN3),置-80℃超低温冰箱冻存。尿样代谢谱测定方法:取尿样200μL,加20μL十七烷酸(1mg·mL-1)、400μL丙酮,涡旋混匀,冰浴超声30min,10000r/min超速冷冻离心10min,取上清液400μL氮气吹干,加入50μL甲氧胺吡啶溶液(15g·L-1),于70℃烘箱反应1h,加75μL衍生化试剂[V(BSTFA):V(TMCS)=100:1],于室温下反应1h,加150μL正庚烷终止衍生化反应。离心取上清液,进入气相色谱-质谱联用仪,用色谱柱DB-5MS进行分离。色谱条件:氦气作为载气,流速1.0mL·min-1,不分流,进样量1μL,毛细管柱(30m×25mm×0.25um,Agilent),进样口温度270℃,离子源温度230℃。程序升温:起始温度85℃,保持2min,以10℃·min-1升至180℃,保持10min,以10℃·min-1升至280℃,保持8min。共计41min。质谱条件:电离方式EI,电子能量70eV,扫描范围60~600m·z-1,全扫描方式,电压0.75~0.8kv,溶剂切割为5.0min。生化数据以“均数±标准差”表示。组间均数比较用t检验,P<0.05或P<0.01表示差异具有显著性。造模成功后1周内,Ⅱ型糖尿病模型大鼠FBG明显升高,在之后的4周动态观察中模型对照组大鼠FBG基本稳定,略有上升,与对照组比较差异均具有显著性((P<0.01),见表1。实验第9周末,模型组大鼠TG、CHO明显升高,FINS含量显著降低,与对照组比较差异均具有显著性(P<0.01),如表2。由GC-MS检测分析所得数据,经处理得到矩阵在SIMCA-P软件中进行多维统计分析。采用非监督的PCA方法对正常对照组和模型对照组组样本进行分析,结果表明,第0~5周,样本分离趋势逐渐明显,如图1。第6周后,模型组与对照组之间的代谢轮廓有了清晰的区分,说明糖尿病大鼠成模