sz尾静脉不同给药方法对大鼠糖尿病模型的影响

sz尾静脉不同给药方法对大鼠糖尿病模型的影响

近几十年来，随着生活水平的提高和人口的老龄化，糖尿病的发病率呈全球上升趋势。非慢性疾病的发病率是第一位。目前,糖尿病及其并发症的病因、发病机理尚未完全阐明,其预防和治疗措施仍不完善,因此,建立较理想的动物模型来研究该病的发病机制、预防和治疗具有重要意义。自1960年开始利用链脲佐菌素(streptozocin,STZ)诱发动物糖尿病模型以来,STZ已成为目前广泛采用的糖尿病动物模型化学诱导剂。STZ的给药途径常分为腹腔注射和尾静脉注射,因为尾静脉注射较之腹腔注射具有用药量少,且成模率高的特点,我课题组多采用此方法制备1型糖尿病大鼠的模型,笔者通过多次反复造模,总结出一些实用的实验技巧,现将方法报告如下。1材料和方法1.1实验动物及饲料健康成年雄性(SD)大鼠104只(辽宁医学院实验动物中心提供),约8～12周龄,体重为180～220g,在普通环境下(通风,恒温18～23℃,湿度60%)饲养,喂饲普通饲料,自由饮水。1.2糖仪、试剂和仪器链脉佐菌素(STZ),Sigma公司。微量快速血糖仪OneTouch-ll型,美国强生公司。血糖试纸,美国强生公司。尿糖试纸,广州市珠江生化试剂公司。MPZOOB电子天平,上海天普分析仪器有限公司。1.3实验方法1.3.1大鼠的尿糖检测将实验用大鼠用电子天平称量体重,STZ按45mg/kg体重称取后,溶解于pH值4.5,浓度为0.1mol/L的柠檬酸—柠檬酸钠缓冲液,配制成2%的溶液,过滤器除菌,将禁食12h的大鼠尾静脉注射,观察2h,开始饮食。3d后取尾静脉尖血用OneTouchll型血糖仪检测血糖,并同时测尿糖。以尿糖(+++)以上,空腹血糖16.5mmol/L以上,出现多尿、多饮、多食症状的大鼠即为造模成功的糖尿病大鼠。实验期间大鼠正常饮食水。未成模的大鼠于7d后再次尾静脉注射STZ。1.3.2尾静脉给药、补药实验一:非盐水导入组:2%STZ溶液直接尾静脉推入;盐水导入组:尾静脉给药前先用0.35mL的盐水导入,然后再推2%STZ溶液。实验二:未成模的大鼠再次补药,分为:全量组:按体重全量静脉注射STZ溶液补药;2/3全量组:按2/3全量尾静脉注射STZ溶液补药。1.4观察指标观察造模后各组的成活数量的变化,大鼠的一般状态、摄食量、饮水量及排尿量;监测3d、4w、8w血糖的变化。1.5处理数据数据以x¯±sx¯±s表示,均数间比较采用χ2检验及重复测量方差分析,全部统计在SPSS13.0软件上进行。2结果2.1盐水导入对大鼠的成活率和成模率的影响两组间比较P<0.01,说明盐水导入方法可以明显提高大鼠成活率(73.9%),而在非盐水导入组大鼠的死亡率很高(48.3%),严重影响了成模率(39.6%),予以盐水导入后大鼠的成活率和成模率明显提高,死亡率降至6.52%(表1)。当第一次造模未成功时需要补造模,实验结果表明,全量组与2/3全量组比较,两组间无统计学差异。此时给与全量的2/3的STZ,就可达到较高(80%)的成模率,且大鼠死亡率也极低(6.67%)见(表2)。2.2感染的表现表现随着病程的进展,实验组大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食、搔痒、毛失去光泽、脱毛、消瘦、活动减少和易感染等表现,2只出现烂尾。6只出现上呼吸道感染,观察12w,实验组大鼠体重减轻20%,饮水量增加近3倍。2.3成模后血糖稳定分别于3d、4w、8w取尾血检测血糖,各时间点各组间血糖值无显著差异性(P>0.05),说明成模后血糖稳定,各组均无明显血糖回退现象(见表3)。3改良用盐水导入stz的方法,有利于大鼠成模率的提高国内外大量的实验研究表明,1型糖尿病的发病机制主要是由于Th1细胞(1型T辅助淋巴细胞)介导细胞免疫应答破坏胰岛β细胞,在发病后期,逐渐转为Th2细胞(1型T辅助淋巴细胞)介导的体液免疫应答,对Th1细胞产生抑制作用,使对胰岛细胞的破坏具有减轻作用。一旦T细胞凋亡发生障碍未被清除而存活下来,在一定条件下就会发生自身免疫性疾病。以往研究表明,链脲佐菌素致动物血糖升高,主要是选择性损伤胰岛β细胞,导致体内胰岛素分泌绝对不足。引起血糖水平改变分为3个时相,早期高血糖,持续约1～2h,继而因胰岛β细胞破坏,大量胰岛素释放引起低血糖,持续约6～10h,24h后开始持久稳定的高血糖状态。本实验非盐水导入组动物死亡率极高,影响成模率,因此在此基础上改良用盐水导入,即及在STZ推入前头皮针的导管内抽入盐水针头刺入尾静脉回血后再接入抽有STZ的注射器。因STZ的溶液pH值偏酸,因此进入大鼠血管后对血管有较强的刺激性,用盐水导入后一方面可以节省药物不必要的浪费,另一方面可减小对血管的刺激性,并对注入血管内的STZ浓度有适度的缓冲作用。实践证明其的确能减低STZ的细胞毒性,降低大鼠的死亡率,从而提高其成模率,从两组未成模率来看(P>0.05)两组并无统计学差异,因此用盐水导入STZ的确是提高成模率、降低实验成本行之有效的办法。本实验还通过再次补造模的实践总结出,补造模时,使用2/3全量的STZ溶液,即可达到成模的效果,两组成模率(P>0.05)无统计学差异,死亡率明显减低(P<0.05)。此结果与文献上已有研究结果显示,以小剂量多次注射STZ的方法建立的1型糖尿病动物模型的结论相类似,但不同的是再次给药的时间点和计量有所不同。其机理,可能与用低剂量的STZ处理易感动物导致胰岛细胞的持续性破坏,自身抗原的释放,诱导自身反应细胞克服了免疫系统的自我耐受,打破了机体的免疫自稳状态,发生针对胰岛细胞的自身免疫反应,引起对胰岛细胞的破坏效应。自身抗原成分的进一步释放,进一步促进免疫应答的发生,造成稳定持久的1型糖尿病的发生。改良方法后,STZ成模率已基本与一些文献报道的可达80%～90%的成模率相接近。笔者通过长时间喂养糖尿病大鼠,还总结出几点经验:(1)造模前大鼠应适应性喂养1周左右,体重维持在180～220g之间,保持良好的营养状态;(2)STZ和柠檬酸缓冲溶液必须低温保存,新鲜配制,短时间内用完;(3)大鼠禁食应达到12h,空腹可提高成模率,注射STZ后,应观察2小时左右,给予充足饮水及食物;(4)饲养室内通风良好,氨浓度