新型固定化酶载体的制备与性能研究

新型固定化酶载体的制备与性能研究

甲基丙烯酸甘油三酯是一种含有多官能团的丙烯酸酯衍生物。结构中的不均匀二醇很容易形成共聚反应。活性强的环氧树脂可以水解成羟基，增加亲水性，这很容易与氨基酸、胺基和其他官能团产生开环反应。这是一种新的基质。它主要用于丙烯酸粉末涂料、乳胶涂料、纺织皮革整理剂、胶黏剂、医药等。Kramer等以甲基丙烯酰胺、N,N′-亚甲基双甲基丙烯酰胺、甲基丙烯酸缩水甘油酯和丙烯基缩水甘油醚等单体共聚化合得到一种具有环氧活性基的多孔球状载体。这种载体固定化青霉素酰化酶具有许多优良特性:多孔性特征为酶蛋白的固定提供了较大的空间和表面。Ding等制备了基于聚甲基丙烯酸盐-二乙烯基苯树脂载体的固定化木瓜蛋白酶,他们通过戊二醛的横向交联或重氮化合物共价结合的方法将木瓜蛋白酶固定在聚合物表面。研究结果表明,固定化木瓜蛋白酶显示出了优异的使用稳定性能,良好的再使用能力和顽强的环境适应能力。目前,德国Rom公司生产的一种商品名为EupergitC的酶固定化载体,该载体富含环氧基团。EupergitC对酶蛋白具有吸附能力,载体所具有的多孔性,为酶蛋白的固定提供了较大的空间和表面积。研究表明,含有环氧基团的高分子聚合物,表面的环氧基团可以在十分温和的条件下与酶分子中的氨基进行共价结合,使酶分子固定于聚合物载体表面,从而一步实现酶的固定化。但由于酶经传统共价结合法固定后活力回收率较低,故采用在固定化酶载体上连接一定长度的亲水性分子链,通过戊二醛交联吸附后再与酶结合,这样的柔性载体在固定化过程中有足够的缓冲作用,可以最大程度地保持酶的原有构象和酶蛋白的自恢能力,基于这种认识,本实验采取有机胺与该新型载体发生胺解反应。不少学者对GMA与二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA)共聚体系进行了深入而细致的研究。本工作采用传统悬浮聚合法制备了GMA-EGDMA-DVB三元共聚物,对载体的孔结构和载体在不同溶剂中的溶胀行为进行了研究,并以有机胺对载体进行胺解行为研究,最后对载体进行固定化木瓜蛋白酶的实验。1实验部分1.1化学试剂及试剂甲基丙烯酸缩水甘油酯、二乙烯基苯(DVB),蓝晓公司提供,工业级;二甲基丙烯酸乙二醇酯(EGDMA),合肥安邦化工有限公司,化学纯;明胶,天津市致远化学试剂有限公司,生化试剂;过氧化苯甲酰(BPO),上海山浦化工有限公司,化学纯;甲苯,天津市富宇精细化工有限公司,分析纯;聚丙二醇(PPG)系列,江苏海安石油化工有限公司,工业级;乙二胺,天津市天力化学试剂有限公司,分析纯。1.2观察聚合物的表征红外吸收光谱在TENSOR27傅里叶红外光谱仪(美国BRUKER公司)上测定,用KBr压片。观察聚合物形貌用DMM-330型电子显微镜(上海蔡康光学仪器有限公司)和JSM-6700F型扫描电子显微镜(日本电子株式会社JEOL)。孔结构由Autopore9500压汞仪表征。酶活性的测定方法通过UV751GD紫外分光光度计(上海仪器分析总厂)来完成。1.3树脂颗粒的制备向装有搅拌器、回流冷凝管和温度计的1L三口瓶中加入360mL含1%明胶、15%NaCl的水溶液,升至一定温度,搅拌30min后加入GMA18.9g、一定量的DVB和EGDMA、一定比例的甲苯和其它致孔剂、0.3gBPO、数滴次甲基蓝,控制一定的搅拌速度,使液滴分散至规定大小,之后继续升温至65℃,聚合2h,再升温至85℃,聚合6h,停止反应,过滤得到固体球状产物,再用热水、缩甲醛和冷水洗涤,置于真空烘箱中干燥至恒重,得到有一定孔结构的树脂颗粒。1.4丙酮索氏的提取采用有机胺对载体树脂进行胺解反应以引入活性胺基基团。称取一定量的载体和乙二醇,溶胀24h后,加入一定量的乙二胺或多乙烯多胺,在65℃反应6h,冷却,产物用大量去离子水冲洗至中性,丙酮索氏提取12h,真空干燥。1.5载体溶胀系数、溶胶率和弱碱交换量的测定失水率测定将树脂离心去掉表面水分,用电子天平准确称取约1g到称量瓶内,(105±2)℃干燥2h再次称重。X=[(m2-m3)/(m2-m1)]×100%,其中m1为空称量瓶的质量;m2为湿态树脂加称量瓶质量;m3为烘干后树脂加称量瓶质量。树脂的失水率即为1-X。载体溶胀系数的测定选用不同溶度参数的溶剂包括水,浸泡一定量载体24h后,测定载体浸泡前后的体积变化,则可得到共聚物载体的溶胀率W=[(V1-V0)/V0]×100%,式中V0、V1分别为载体溶胀前后的体积。环氧基浓度的测定参考文献[12-13]。胺化树脂弱碱交换量测定用减量法称取mg树脂,在锥形瓶中加入100mL浓度为C1mol/L的标准盐酸,浸泡,振荡过夜,反应完全后准确吸取25mL的上层清液于锥形瓶中,以酚酞为指示剂,用浓度为C2mol/L的标准NaOH溶液滴定至微红色,消耗NaOH溶液为V2。用以下公式计算树脂的弱碱交换量X(mmol/g)=(100C1-4C2V2)/m1.6固定化酶载体的制备称取一定量酶粉,用pH值7.2的磷酸缓冲液(0.1mol/L)配成1g/L的酶液,向装有0.5g经由戊二醛交联后的载体的锥形瓶中加入20mL配好的酶液,室温下,在摇床中振荡反应12h,吸取上层酶液,用磷酸缓冲液清洗固定化酶载体。所得固定化酶放于4℃冰箱中保存。1.7酶活性的测定木瓜蛋白酶的一个活力单位(U)相当于单位时间内释放1µg的酪氨酸。酶活力测定按文献进行。2结果与讨论2.1gma-egda-dvb产品的结构表征图1(1)是GMA单体的红外谱图,在1722cm-1处有酯基的羰基吸收峰,在908cm-1、844cm-1、815cm-1处有环氧基吸收峰。图1(2)是GMA-EGDMA-DVB共聚物的红外谱图,可以看出在908cm-1、846cm-1处出现了环氧基的醚键(C—O—C)的伸缩振动吸收。从产物的红外谱图可以看出,合成的新型载体中含有反应性环氧功能基。根据此基团的特性可以研究载体的功能化反应。利用扫描电子显微镜研究了三元共聚物的微观结构,如图2所示。从SEM照片可以看出,共聚物有很好的球形度和粒径分布,粒径分布较为狭窄,主要在0.105~0.211mm之间,共聚物内部孔道分布均匀。2.2反应时间时间失水率的测定树脂的孔容对树脂的固定化酶性能有非常大的影响。本文在制备树脂时,加入了甲苯及PPG系列作为致孔剂。树脂的失水率在一定程度上可以反映树脂孔容的大小,图3为不同反应时间时失水率的大小,由此可以说明所制备的树脂具有比较大的孔容,能够满足后续固定化酶的需求。从图3分析可知,曲线变化与共聚过程中相应阶段孔容的理论变化大致相同,聚合过程中交联微球聚集,大孔结构的微球逐渐生成,孔容不断增加,聚合结束,水蒸气蒸馏开始,孔开始收缩,孔容开始减小。2.3交联剂对聚合物支撑结构和性能的影响2.3.1孔径分布的变化其它条件不变情况下,只改变交联剂的用量,用压汞仪对不同交联度的载体孔结构进行了表征,结果见表1。交联剂一般为多官能团化合物。交联度的增加使得共聚初期链内交联和共聚过程中链间交联的程度加剧,微凝胶和微孔数量增多使平均孔径和孔容减小,比表面积增大。当交联强度增加到一定值时,比表面积不再增大。表1中的样品4的孔径分布曲线见图4。由图4可知,采用甲苯和PPG1000为致孔剂制备出的颗粒的孔径在26nm以下分布的比较多,从压汞仪数据可知,在26nm以下的孔区占总孔体积的85.1%,最小孔径达到约5.84nm,总孔隙率为66.54%。2.3.2联席会议度对dma活性的影响随后对胺解反应后的载体进行了固定化木瓜蛋白酶的实验,结果如图5所示。木瓜蛋白酶与经由戊二醛交联吸附后的5种不同交联剂用量的载体键合固定化后都能表现出较高的酶活性。当致孔剂量一定时,随着载体交联度的升高,固定化酶的活力均有一定提高,但达到一个最高值后又有下降现象。这是因为当交联度逐渐增大,载体的孔结构得到改善,比表面积增加,有利于孔胀大过程,因而溶胀性能改善,有利于酶活力的提高。但当交联度过高时,由于交联过于密集,孔径减小,其不利酶活性的发挥而导致活力下降。当交联度为35%的时候,活性最大。从图6可知,随着载体交联度的增长,测得的载体环氧基浓度呈下降趋势。这是由于交联剂用量的增加,也就意味着降低了单体GMA的投料量,因而环氧基的含量会减小,另外交联剂用量越高,共聚物内部的网状结构越致密,这样就使得戊二醛交联反应的位点减少,进而导致载酶量的减少,表现为固定化酶的酶活也随之下降。但是交联度太低会影响载体的机械强度,因此交联度以确保载体合适机械强度为宜。此外本文还研究了重复反应5次后的固定化酶,酶剩余活力保持在80.1%左右,说明其具有较好的操作稳定性。在该悬浮聚合体系中,交联剂的用量对共聚物的表面性质及孔结构产生影响,从而影响着聚合物对木瓜蛋白酶的固定化效果。2.4分子密度对活性物质表达的影响载体的溶胀性能是影响其固定化酶等生物活性物质的重要因素,适当的溶胀可以使载体骨架间的空隙增大,有利于提高酶等生物活性物质分子在载体内部的传质速度,并使载体分子链上的反应性环氧基得以充分利用。载体在水、甲醇、乙二醇、DMF、丙酮、甲苯中的溶胀情况如表2所示。由表2可知,载体在DMF和乙二醇中溶胀情况最优,但又由于DMF毒性较大,故采用乙二醇溶胀。2.5gma-dvb-egda的胺化前后的谱图分析基于引入亲水性分子链,为了探讨酶等生物活性物质与环氧基载体之间发生化学反应的理论依据,研究了载体与一些有机胺化合物的胺解反应。图7是载体与乙二胺发生胺解反应所形成的共聚物的红外谱图,比较GMA-DVB-EGDMA树脂胺化前后的谱图发现,3100~3500cm-1为—NH2的吸收峰,酯羰基的特征吸收峰有所移位,同时在1680cm-1处出现了酰胺羰基的特征吸收峰,胺化后树脂谱图中环氧基的吸收峰明显减弱,而且3300cm-1左右的吸收峰加强,而胺基的特征吸收峰刚好出现在这里。另外通过对载体元素分析,N、C、H元素含量分别为2.68%、56.91%、8.317%,可以得出产物中含有氮元素,由此可以说明在共聚物上的环氧基与胺基发生胺解反应,从而为载体用于酶等含有胺基的生物活性物质分子的固定化提供了依据。2.5.1胺化试剂种类对固定化酶活性的影响用乙二胺、己二胺、二乙烯三胺、三乙烯四胺等多乙烯多胺,于相同条件下对多孔树脂进行胺解。如图8所示。从图8可以看出,在胺化试剂过量的情况下,固定化酶的活性随着胺化试剂种类的不同变化不大,其中四乙烯五胺所对应的固定化酶的活性偏大。这主要是因为四乙烯五胺提供的胺量大,能结合更多的环氧基团,这样酶分子在物理吸附和化学共价结合的共同作用下更多地连接在载体上,显示出更高的酶活性。2.5.2不同交联度对树脂胺化的影响树脂被胺解过后,其含有伯、仲、叔胺基,这一类的阴离子交换树脂称为弱碱树脂。以下讨论交联度和溶胀剂对胺基弱碱交换量E的影响。当选择试剂为乙二胺,交联度对产物弱碱交换量的影响见表3。由表3可知,弱碱交换量随着交联度的增大而减小,当交联度由15%增大到55%,树脂弱碱交换量由7.19mmol/g减小到4.95mmol/g。这种变化的原因如下:一由于交联度的增加,树脂表面可胺解的酯基数量减小;二是由于交联度的增加,树脂骨架结构趋于紧密,反应基团的可接近性降低。溶胀剂对树脂胺化有较大的影响,具体见表4。实验结果表明,用正丙醇和异丙醇为溶胀剂,所得的树脂有较大的交换容量,并不发生结块,异丙醇来源较广泛,价格较便宜,沸点较低,有