糖尿病大鼠全脑缺血再灌注后海马区磷酸化ku70的表达

糖尿病大鼠全脑缺血再灌注后海马区磷酸化ku70的表达

据报道，高血压可以加剧脑损伤，这是脑损伤发病率和死亡率增加的重要独立危险因素。糖尿病患者中风发病率明显高于非糖尿病患者,且脑损害的严重程度、中风死亡的可能性均增加,预后较差。有关糖尿病加重脑缺血损伤的机制尚未明确。脑缺血损伤时,脑内异常代谢可造成神经细胞DNA损伤,受损DNA可通过DNA修复酶进行修复,提高神经元的缺血耐受能力,但如果DNA修复功能减弱,则会导致基因突变,细胞发生死亡。Ku70蛋白是细胞修复DNA依赖蛋白激酶(DNAdependentproteinkinase,DNA-PK)的调节亚单位,主要参与DNA双链断裂的修复,并起到增加DNA修复效率和修复正确性的作用。本研究应用糖尿病联合脑缺血再灌注模型,观察实验大鼠海马区Ku70表达变化以及神经细胞凋亡情况,初步探讨Ku70与糖尿病加重脑缺血再灌注神经元损伤的关系,为临床糖尿病并发缺血缺氧性疾病的防治提供实验依据。1材料和方法1.1免疫组化试剂多克隆Ku70抗体和内参β-actin(SantaCruz公司);多克隆磷酸化Ku70免疫组化试剂盒(中杉生物有限公司,北京);TUNEL试剂盒(SantaCruz公司,美国);透射电镜H-7650型(日本);图像采集及图像分析系统(美国Bio-Rad生物仪器设备公司)。1.2大鼠全脑缺血模型的制作120只健康雄性SD大鼠由北京维通利华实验动物中心提供(SCXK(京)2005-0013),体重(185±19)g。随机分为假手术组(shamoperation)和血糖正常全脑缺血再灌注组(normoglycemiaglobalcerebralischemia-reperfusion)及糖尿病全脑缺血再灌注组(diabeticcerebralischemia)。血糖正常全脑缺血再灌注组采用改良的Pulsineli4血管阻断(4-VO)法制作大鼠全脑缺血模型。水合氯醛(350mg/kg)麻醉动物,切开颈正中,分离双侧颈总动脉,置线颈总动脉下方备用。枕后部沿正中切开,暴露双侧第1颈椎横突翼孔,椎动脉行于其下方,直视下电凝椎动脉,使翼小孔后双侧椎动脉完全闭塞,每次电凝时间约2～4s。术后大鼠缝皮回笼,24h后以无创性微动脉夹同时夹闭双侧颈总动脉30min,之后松开进行再灌注。缺血及再灌注期间用红外线测温仪监测耳内鼓膜温度,并维持在(37±0.2)℃。假手术组只进行分离暴露血管处理,但不电凝椎动脉、不夹闭颈总动脉。糖尿病全脑缺血再灌注组:大鼠术前禁食12h,按55mg/kg腹腔注射链脲佐菌素(streptozocin,STZ),72h后空腹血糖超过16.7mmol/L,有多尿、体重下降等表现的大鼠为糖尿病造模成功。然后按上述全脑缺血模型进行手术,制作糖尿病全脑缺血再灌注模型。每组又随机分为缺血再灌注1、6、24、48h时间组,各时间点n=10。分别进行以下检测。1.3海马组织病理学染色各组各时间取2只动物,动物常规麻醉,混合固定液(25mL/L戊二醛和20g/L多聚甲醛的磷酸缓冲液)心脏灌注30min,断头取海马组织切成约1mm×1mm×1mm组织块,立即放入40mL/L戊二醛固定3～4h,0.1mol/L二甲砷酸缓冲液冲洗2遍,再经10g/L四氧化锇固定,缓冲液冲洗,逐级丙酮脱水,环氧树脂浸透、包埋、超薄切片后,用醋酸铀枸橼酸铅进行双重染色。透射电镜观察脑细胞形态及超微结构变化并摄片。1.4免疫组化法检测海马组织中的阳性细胞各时间点处死4只动物,40g/L多聚甲醛行心脏灌流,断头取脑,在视交叉后1～6mm处冠状面切开,取中间块入40g/L多聚甲醛固定液固定,石蜡包埋,切片(片厚5μm)。切片常规脱蜡至无水,枸橼酸盐微波修复,滴加Ku70抗体(1∶200),置湿盒内4℃冰箱过夜,PBS冲洗3次,5min/次,切片上滴加IgG抗体-HRP多聚体(PV二步法),置湿盒内37℃温箱30min,PBS冲洗3次,DAB显色、脱水、透明、封片。阳性率的定量分析:每个标本取5张切片,200倍光镜下每张切片在海马随机选取5个视野,在有测微尺的光学显微镜(×200)下,应用Motic-6.0图像采集及分析系统,分别观察海马区阳性细胞变化并计数阳性细胞数量。各时间点处死4只动物,快速于冰上剥离海马组织,称量0.6g,加入裂解液,冰浴中匀浆,4℃离心5min,3000r/min,取上清,考马斯亮蓝法蛋白质定量,样品制备,转膜、加入抗体(Ku70,1∶2000;β-actin,1∶2000)、室温孵育2～3h,加入二抗、封闭,ECL显色。Bio-Rad系统进行吸光度测定,以目的条带与内参照β-actin的平均吸光度的比值表示蛋白水平,进行半定量分析。1.5dab吸光度切片常规脱蜡至水,滴加蛋白酶K湿盒中37℃孵育30min,滴加TUNEL混合溶液,50μL/片,湿盒中37℃孵育60min,滴加转化剂AP,50μL/片,湿盒中37℃孵育30min,DAB显色、脱水、透明、封片。阳性率的定量分析:每个标本取5张切片,每张切片在海马随机选取5个视野,在有测微尺的光学显微镜(×200)下,应用Motic-6.0图像采集及分析系统分别观察海马区阳性细胞变化并计数阳性细胞数量,取均值。1.6术后大鼠评分情况由2位参与实验的人员分别以单盲法对48h时间点实验动物进行评分和记录,然后将2组的均值作为最后得分。运动功能:开放场地活动检测由实验者将老鼠放入空旷开放场地,按照生理反应正常大鼠应该贴屋里四面墙壁行走,术后大鼠分无活动、移动但不贴墙壁、贴墙走1～2侧墙壁、贴墙能走3～4侧墙壁4个等级;肢体平衡性检测将大鼠放于平地上,观察肢体运动,分左前肢无运动、稍运动、不规则运动、对称性伸展4个等级;筛网攀爬检测将筛网悬空固定,协助大鼠抓住筛网,松手观察,分抓不住、抓握小于4s、抓握不移动、移动穿越4个等级;平衡性检测将木杆悬空固定,大鼠置于木杆上,分掉落小于2s、掉落大于2s、抓木杆不移动、移动穿越木杆4个等级。分别给予0～3分。感觉功能:本体感觉检测分无旋头反应、不对称旋转、对称旋转3个等级;触须检测分为无反应、头不对称旋转、对称旋转;触颈检测分为无反应、退缩迟缓、立即退缩。分别给予1～3分。1.7观察指标及方差分析应用SPSS17.0统计分析软件对数据进行数据处理,TUNEL阳性细胞以及Ku70指标的组间比较采用析因设计资料方差分析方法,神经功能评分的各组间比较采用单因素方差分析,数据以均值±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,以P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1糖正常脑缺血再灌注组各时间点胞核电子密度及损伤的情况假手术组中神经元结构正常,细胞核规则,核仁清晰,核质均匀散在,核膜光滑,边缘清晰。神经细胞轴索、微管正常;轴索结构排列正常。血糖正常脑缺血再灌注组各时间点可见神经细胞不同程度固缩,胞核电子密度增高,核膜凹陷或断裂,轴索排列紊乱、肿胀,髓鞘泡鼓、内折及分层,轴索变性、断裂等,以24、48h损伤最严重。糖尿病脑缺血再灌注组中神经元细胞损伤进一步加重,染色质聚集明显,基质出现大量空泡,核膜模糊、断裂,细胞器数量减少,仅见极少量细胞器,髓鞘严重分层,一些部位出现断裂,以24、48h损伤最为严重(图1)。2.2两组各时间tunel阳性细胞的表达情况比较凋亡神经细胞表现胞核固缩呈棕黄色。假手术组海马区只有极少数阳性细胞。与假手术组比较,血糖正常全脑缺血再灌注组各时间TUNEL阳性细胞均增多,48h达高峰(P<0.05);与血糖正常全脑缺血再灌注组比较,糖尿病全脑缺血再灌注组中各时间点TUNEL阳性细胞阳性细胞增多,48h达高峰(P<0.05,图2、表1)。2.3糖尿病全脑缺血再灌注后ku70表达变化免疫组化检测Ku70阳性表达主要位于细胞核,阳性细胞的胞质可见细小的棕黄色颗粒。假手术组可见一定量Ku70阳性细胞。与假手术组比较,血糖正常全脑缺血再灌注组1、6h时间点Ku70阳性细胞增多,24、48h迅速下降;与血糖正常全脑缺血再灌注比较,糖尿病全脑缺血再灌注组中各时间点Ku70阳性细胞减少。免疫印迹检测结果显示Ku70条带清晰,以β-actin的吸光度值作为内参照,对各组条带的吸光度值进行校正和半定量分析。与假手术组比较,血糖正常全脑缺血再灌注组中Ku70蛋白水平在1、6h时间点上调,24、48h迅速降低(P<0.05);与血糖正常全脑缺血再灌注组比较,糖尿病全脑缺血再灌注组中Ku70蛋白水平各时间点持续减少(P<0.05,图3、图4、图5)。说明糖尿病可加重全脑缺血导致的Ku70蛋白减少。2.4假手术组与假手术组治疗前后血压比较血糖正常全脑缺血再灌注组动物运动和感觉功能评分(7.64±1.21,6.64±0.65)低于假手术组(11.71±0.47,8.75±0.44);与血糖正常全脑缺血再灌注组比较,糖尿病全脑缺血再灌注组(4.79±0.93,4.42±0.72)运动及感觉功能评分进一步降低,差异有统计学意义(P<0.05)。3糖脂质蛋白及金属酶激活FARROKHNIA在局灶性脑缺血再灌注模型中发现,缺血再灌24h,高血糖大鼠较正常血糖组出现了更为明显的脑组织损伤、梗死面积的扩大;马轶采用双血管阻塞联合放血法建立大鼠全脑缺血模型,利用TUNEL染色发现糖尿病鼠在急性期(缺血再灌注1、3h)凋亡神经细胞数量明显高于正常血糖脑缺血组。本研究结果显示糖尿病脑缺血组大鼠海马区神经细胞超微结构破坏程度、凋亡神经细胞数量以及神经功能损害程度均明显高于血糖正常脑缺血再灌注组,尤其在24h损伤更明显。提示糖尿病可加重脑缺血管疾病发病后的病理损伤。但糖尿病增加脑缺血后神经细胞死亡的机制尚未明确。Ku70是哺乳动物中修复DNA断裂双链修复酶的调节亚单位,DNA损伤时,Ku70首先与损伤DNA结合,激活DNA修复酶而启动整个修复过程,同时增加DNA损伤修复的正确性。SHACKELFORD等研究发现,兔脊髓短暂缺血再灌注引起的可逆性神经损伤伴有Ku蛋白结合DNA活性的升高;而严重的缺血再灌注导致永久性的神经缺损时Ku蛋白结合DNA的活性降低。电刺激预处理可上调局灶脑缺血模型中Ku70的表达,增强DNA修复能力,发挥其内源性神经保护作用,减轻脑缺血再灌注损伤。本研究中血糖正常脑缺血组1、6hKu70阳性细胞及表达增加,24、48h迅速减少,神经细胞凋亡在6h开始大量出现。推测在脑缺血早期,脑内异常代谢引起DNA损伤时,应激引起Ku70短暂增加,增强细胞修复能力,因而大部分细胞处于存活状态,随缺血时间的延长,Ku70下降,修复酶的修复功能减退,导致大量细胞坏死或凋亡。本研究结果显示,与血糖正常脑缺血组比较,糖尿病脑缺血组Ku70在1h即开始明显减少,未出现一过性增高现象,持续减少至48h,各时间凋亡神经细胞数量进一步增加,表明Ku70蛋白减少全面贯穿糖尿病脑缺血再灌注病理进程,是糖尿病增加脑缺血后神经细胞丢