益气酰胺汤对d-半乳糖鼠免疫功能的影响

益气酰胺汤对d-半乳糖鼠免疫功能的影响

现代研究表明，免疫功能下降是衰老的主要原因之一。祖国医学认为脾虚是衰老的重要原因。李东垣是“补土派”的代表人物,他提出了“内伤脾胃,百病由生”的论点,而益气升阳法是其补土的主要法则,其益气聪明汤是其代表方之一。笔者运用该方在治疗老年人脑动脉硬化、老年痴呆、耳鸣耳聋等常见病、多发病以及在缓解疲劳、增强记忆力等方面均取得良好疗效。基于此,本实验采用D-半乳糖皮下注射建立衰老动物模型,从衰老发生的免疫学说角度探讨益气聪明汤延缓衰老的作用机理。1材料表面1.1动物和主要试剂的外观1.2实验药物2方法2.1小鼠衰老模型参照文献和造模预实验结果,除正常对照组外,其余各组均无菌操作颈背部皮下注射5%D-半乳糖生理盐水0.25ml/(10g·d),每天一次,连续42天,造成小鼠衰老模型。同时正常对照组无菌操作颈背部皮下注射0.9%的生理盐水0.25ml/(10g·d)。2.3脾淋巴细胞增值活性测定2.3.1血清采集实验第42天,用10%水合氯醛(4ml/kg)腹腔麻醉后,分离出颈动脉,剪断取血,用台式离心机离心10分钟,吸取血清,做好标记,-20℃保存待测。2.3.2胸腺指数、脾脏指数的测定实验结束后,将小鼠称重,各组经取血后,脱颈处死,75%酒精浸泡消毒,于超净工作台中无菌取出脾脏、胸腺,电子称称重,以脏器湿重(mg)/体重(g),表示小鼠脾脏指数和胸腺指数。2.3.3血清IL-2的检测采用放免法。2.3.4MTT比色试验测定脾淋巴细胞增值活性2.3.5脾淋巴细胞悬液制备参照文献,将脾脏放入盛有10ml无菌Hanks液平皿的100目铜网上,用无菌注射器芯挤压研磨,使单个细胞经网进入Hanks液中。移吸细胞悬液至刻度离心管中,800r/min,离心10min。经Tris-NH4Cl除去红细胞,Hanks液洗3遍,镜下细胞记数,用含3%小牛血清(FBS)的RPMI1640完全培养液配成8×106/ml细胞悬液。2.3.6脾淋巴细胞增值活性的测定T淋巴细胞增殖活性测定:参照文献,将不同组的脾细胞悬液各取100μl分别置入96孔细胞培养板内。每鼠各设6个重复孔,其中3孔作为自发增殖对照孔,加入含3%小牛血清的RPMI1640完全培养液100μl/孔;其余3孔作为刺激增殖孔加入ConA100μL/孔(终浓度为5μg/ml)。置37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱中培养48h后取出,每孔加入5mg/ml的MTT10μl,继续放入培养箱培养6h后取出,贴壁吸上清液弃之,加入二甲基亚砜(DMSO)100μL/孔,充分振荡后,静止10min,在酶标仪上波长570nm处测定OD值。B淋巴细胞增殖活性测定:参照文献,将刀豆蛋白A(ConA)换成脂多糖(LPS)20μl/孔(终浓度为50mg/L),其余操作与T淋巴细胞增殖活性测定相同。2.3.7淋巴细胞增值活性的结果分析参照文献,为避免淋巴细胞自发增殖作用的干扰,本实验采用ConA、LPS刺激脾淋巴细胞净增值为检测指标,即脾淋巴细胞净增值(用ΔOD表示)等于ConA、LPS刺激脾淋巴细胞增殖孔的OD均值与自发增殖对照孔的OD均值之差。3处理数据用SPSS11.5统计软件进行数据处理,实验结果以均数±标准差(x¯±s)(x¯±s)表示,组间比较采用单因素方差分析。4结果3.1一般情况下3.2各组大鼠免疫器官指数的比较见表13.3组大鼠血清中、小剂量及预测结果如表2示:与正常组比较,大剂量组IL-2含量无明显差异(P>0.05);模型组、VitE组、小、中剂量组显著降低(P<0.01)。四个治疗组与模型组比较均显著升高(P<0.01)。四个治疗组之间比较:VitE组与中、小剂量组之间无明显差异性(P>0.05);大剂量组显著高于小剂量组、VitE组(P<0.01),也明显高于中剂量组(P<0.05)。3.4各组脾淋巴结更新活性的比较见表34对特殊大鼠血清il-2、t细胞和b细胞的作用脾虚衰老学说是祖国医学众多衰老学说中最重要的之一。益气聪明汤用药严谨,黄芪、人参为君,益气升阳;葛根、升麻为臣升举脾胃清阳,君臣合用,益气升阳举陷。佐以白芍、蔓荆子养肝明目,蔓荆子兼清利头目;黄柏泻火坚阴,又防葛根、升麻升发太过;使以炙甘草,益气和中,调和诸药,合用则中气充足,清阳上升,浊阴得降,九窍通利,耳聪目明。临床中,我们运用益气聪明汤治疗老年人常见病、多发病往往取得良好疗效。随增龄,免疫器官老化,免疫细胞及细胞因子发生改变,机体的免疫功能逐渐减弱,感染性疾病、癌症等发病率、死亡率增高,免疫衰老与个体寿命之间的联系得到了大量证据支持。胸腺是免疫系统的中枢器官,是T淋巴细胞分化成熟的场所,对维持细胞免疫和调节免疫反应起重要的作用。脾脏作为外周免疫器官,随增龄而逐渐减小,性质发生改变,是衰老时免疫功能降低的原因之一。T、B淋巴细胞是免疫系统的核心。T淋巴细胞主要介导细胞免疫。T细胞杀伤作用及产生细胞因子的能力降低是导致衰老及多种疾病和肿瘤等的重要原因,随增龄T细胞在体外增殖能力下降。T细胞功能也发生改变,老年人及动物T淋巴细胞对有丝分裂(ConA、PHA等)抗原刺激的增殖能力降低。B淋巴细胞主要介导体液免疫,能分泌多种细胞因子调节免疫应答。老年时B细胞功能以及在同样抗原强度刺激下所动员的B细胞数明显减少,仅及正常小鼠1/10-1/50。IL-2由激活的T细胞产生,主要有:刺激激活的T细胞增生和产生细胞因子;激活NK细胞、刺激其生长;刺激B细胞增值和(或)分化以及分泌抗体的作用。这些细胞因子在细胞衰老和预期寿命中起着关键作用。本实验表明:与正常组比较,模型组脾脏、胸腺指数;血清IL-2含量;脾淋巴细胞增值活性均显著降低(P<0.01),提示D-半乳糖致亚急性衰老模型小鼠可导致免疫衰老,亦可反证衰老的免疫学说。同时益气聪明汤三个治疗组均能有效升高小鼠免疫器官指数、血清IL-2含量、脾淋巴细胞增值活性,且升高幅度与其剂量基本呈正相关,益气聪明汤大剂量组与正常组相比已经没有明显差异(P>0.05),提示益气聪明汤有良好的增强衰老模型小鼠免疫功能的作用。昆明种小鼠60只,体重18～22g,2月龄,雌雄分养(实验动物由湖南中医药大学实验动物中心提供)。D-半乳糖、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO),Amresco公司;碘[125I]白细胞介素-2放射免疫试剂盒(北京科美东雅);刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS),sigma公司;RPMI1640细胞培养基(Hyclone公司);小牛血清(杭州四季青)。益气聪明汤按《东垣试效方》原方,由黄芪16g、人参16g、炙甘草16g、升麻10g、葛根10g、蔓荆子5g、白芍3g、黄柏(炒黄)3g组成,湖南中医药大学一附院药房提供药材,按传统方法煎煮过滤,并于恒温水浴锅中浓缩至:大剂量:每毫升含生药1.35g;中剂量:每毫升含生药0.675g;小剂量每毫升含生药0.3375g;4℃冰箱保存备用。维生素E胶丸(100mg/粒),广州白云山制药总厂(批准文号:国药准字H44021557)。60只小鼠随机均分6组,雌雄各半,分为:(1)正常组;(2)D-半乳糖模型组;(3)益气聪明汤大剂量组27g/(kg·d);(4)中剂量组13.5g/(kg·d);(5)小剂量组6.75g/(kg·d);(6)维生素E对照组50mg/(kg·d)。在造模的同时,模型给药组分别灌胃相应浓度药物0.2ml/(10g·d);正常对照组、D-半乳糖模型组灌胃0.2ml/(10g·d)的生理盐水。第42天做各项指标检测。2.2组大鼠前拜物酶指标比较除正常组和大剂量组之外,余组均有小鼠死亡,模型组死亡2只,小、中剂量组及VitE组各死亡1只。如表1所示:与正常组比,大剂量组无明显差异(P>0.05);模型组、VitE组、小剂量组脾脏和胸腺指数、中剂量组胸腺指数均显著降低(P<0.01);四个治疗组与模型组比显著升高(P<0.01)。四个治疗组之间比较:大剂量组显著高于小剂量组、VitE组(P<0.01),也明显高于中剂量组(P<0.05)。