白假丝酵母菌生物膜形成过程中耐药性的变化

白假丝酵母菌生物膜形成过程中耐药性的变化

阴道假丝菌病（vvc）是阴道常见的炎症。在vvc中，约80%和90%的核电站是白假丝菌（koda）。现在，在难治性真菌感染的大部分病变中，发现了生物膜（bf）感染的源，这增加了对真菌药物的抵抗力。本课题通过研究VVC白假丝酵母菌在游离状态、4hBF及48hBF状态下氟康唑(Fluconazole,FCZ)的最低抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration,MIC)值,明确生物膜在白假丝酵母菌感染中的作用,为临床治疗提供理论依据。1材料和方法1.1材料表面1.1.1法药敏实验鉴定受试菌株20株为白假丝酵母菌,均来源于VVC患者的阴道分泌物,并经形态学和纸片法药敏实验鉴定均为氟康唑敏感菌株。1株近平滑假丝酵母菌(Candidaparapsilosis)ATCC22019及1株克柔假丝酵母菌(Candidakrusei)ATCC6258为质控株。所有菌株均由北京大学第一医院微生态实验室提供。1.1.2培养基和试剂酵母粉,蛋白胨,葡萄糖,氯化钠(NaCl),氯化钾(KCl),磷酸氢二钠(Na2HPO4),磷酸二氢钾(KH2PO4),沙保氏氯霉素琼脂培养基、科玛嘉显色培养基(北京新隆福医药),氟康唑(中国药品生物制品鉴定所),小牛血清(北京诺其雅生物),荧光染料FITC-ConA(Sigma公司)。1.1.3仪器和细胞培养板荧光显微镜(OlympusBX60),JSM5600-LV电镜(JEOL日本电子),96孔细胞培养板(美国Corning),1cm×1cm盖玻片(北京诺其雅)。1.1.4荧光染料溶液的制备(1)YPD培养液的配制:将酵母粉10g,蛋白胨20g,葡萄糖20g溶解于1L蒸馏水中,分装后高压蒸气灭菌15min,冷却后置4℃冰箱备用。(2)抗真菌药液的制备:将1280μg氟康唑粉末充分溶解于1ml灭菌用水里,制备成浓度为1280μg/ml原液,置于-20℃冰箱备用。同法制备浓度为2560μg/ml原液。保证抗真菌药物原液浓度至少应10倍于药敏实验时的最高浓度。(3)荧光染料FITC-ConA的配制:将FITC-ConA粉末1mg加入用pH7.4PBS液1ml配制成浓度为1mg/ml原液,分装后置于-20℃冰箱备用。使用前将其用PBS液稀释为50μg/ml。1.2方法1.2.1pbs的制备(1)生物膜的制备:盖玻片(1cm×1cm)灭菌后,用小牛血清4℃浸泡12h,然后用pH7.4灭菌的PBS冲洗3遍,将盖玻片转移到6孔板里,然后加入3ml浓度为(0.5～2.5)×106个菌细胞/ml菌悬液,37℃孵育90min,pH7.4无菌PBS冲洗3遍,除去没有黏附的真菌细胞,将冲洗后的盖玻片转移到另一新的6孔板中,每孔加入3mlYPD培养液37℃培养,分别在4、8、12、24、48h用pH7.4灭菌PBS冲洗3遍。(2)荧光染色及显微镜观察:将上述不同时间段的BF盖玻片,每张盖玻片表面滴加FITC-conA(染色浓度50μg/ml)50μl,室温下避光孵育1h,pH7.4无菌PBS清洗除去未结合的染料,置于荧光显微镜下观察。(3)扫描电镜样品制备及观察:将上述不同时间段的BF盖玻片,PBS冲洗后立即用3%戊二醛固定2h,然后经过1%锇酸固定2h、乙醇梯度脱水、乙酸异戊酯浸透、临界点干燥、离子溅射仪喷金镀膜一系列步骤后,置于电镜下观察。1.2.2氟康唑克氏体/酯类耐药药物5(1)菌悬液制备:将受试菌接种在沙保琼脂培养基上,置37℃,传代培养。挑取生长24h直径约1mm白假丝酵母菌菌落3～5个,悬浮于2ml8.5g/L无菌氯化钠溶液中,调整其浊度达到0.5麦氏标准,相当于每毫升含(1～5)×106个菌细胞。用YPD培养基1:50稀释后,再1∶20稀释,使其浓度为(1～5)×103菌细胞/ml。(2)96孔板制备:每排有12孔,除第1孔加入160μlYPD液体培养基外,其余每孔加入100μl,在第1孔加入氟康唑抗真菌药物原液(1280μg/ml)40μl混匀,然后吸取100μl至第2孔,混匀后再吸取100μl至第3孔,如此连续倍比稀释至第10孔,并从第10孔中吸取100μl弃去,第11孔为不含药物的生长对照孔,第12孔为空白对照孔。(3)NCCLS微量滴定法:将浓度为(1～5)×103CFU/ml菌悬液100μl从第1孔到第11孔依次加入事先准备好的96孔板里,每个药物质量浓度均有3孔作为重复。(4)质量控制:以近平滑假丝酵母菌ATCC22019和克柔假丝酵母菌ATCC6258为质控株进行质量控制。(5)结果判读:37℃培养,分别在24h及48h观察结果。评分标准:完全透明0分,雾状浑浊1分;浊度明显降低2分;浊度轻度下降3分;浊度未降低4分。氟康唑由于具有抑菌拖尾现象,故以评分2作MIC,最终以48h的药物浓度作为其对氟康唑的MIC。1.2.3白假丝酵母菌生物膜的制备(1)菌悬液制备:将受试菌接种在沙保琼脂培养基上,置37℃,传代培养。挑取生长24h直径约1mm的白假丝酵母菌菌落3～5个,悬浮于2ml8.5g/L无菌氯化钠溶液中,调整其浊度达到0.5麦氏标准,相当于每毫升含(1～5)×106个菌细胞,用YPD培养基1∶1稀释后,浓度为(0.5～2.5)×106个菌细胞/ml。(2)96孔板法形成白假丝酵母菌生物膜:取浓度为(0.5～2.5)×106CFU/ml100μl菌悬液从第1孔到第11孔依次接种于96孔培养皿中,37℃培养90min,为黏附阶段,用pH7.4无菌PBS冲洗3遍,清除未黏附的真菌细胞,然后每孔加入YPD培养基100μl,37℃继续培养,分别在4h及48h形成不同阶段的生物膜结构,再次弃去培养基及悬浮的白假丝酵母菌,PBS冲洗3遍。(3)生物膜药敏实验:将2倍药物质量浓度(2560μg/ml)以倍比稀释方法(类似于浮游状态下药物稀释方法,不同的是氟康唑最终质量浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml)加到各孔继续37℃培养48h,与生长对照孔相比,以浊度明显减低孔的药物质量浓度为MIC,每个药物质量浓度均有3个孔做为重复。1.3统计处理应用SPSS13.0版本软件,各状态下药敏情况分析使用FriedmanM秩和检验。P<0.05为差异有统计学意义。2结果2.1细胞外多糖基质的分离和复合微菌落的形成4hBF状态下白假丝酵母菌散在分布,开始分泌少量细胞外多糖基质,为菌体黏附,定植阶段,见图1A;8hBF状态下白假丝酵母菌已出现分散的微菌落,并逐渐融合,细胞外多糖基质分泌较前增多,见图1B;24hBF状态下白假丝酵母菌微菌落逐渐增多,并相互融合成团块状;同时分泌细胞外多糖基质增多,逐步覆盖在微菌落表面,见图1C;48hBF状态下白假丝酵母菌菌细胞不断增多,块状菌落更加相互融合;分泌细胞外多糖基质更加明显,几乎完全包裹菌细胞,生物膜初步形成,见图1D。2.2hbf状态下白假丝母菌生长情况4hBF状态下白假丝酵母菌菌细胞以芽生孢子(酵母相)黏附在材料表明,并且菌细胞之间互相黏附形成微菌落,见图2A;12hBF状态下白假丝酵母菌菌细胞数量逐渐增多,微菌落逐渐增大并相互融合,见图2B;48hBF状态下白假丝酵母菌菌细胞已经芽生出菌丝体及假菌丝,菌细胞、菌丝体及假菌丝形成排列密集的网状结构,见图2C;72hBF状态下白假丝酵母菌菌细胞、菌丝体及假菌丝越来越多,相互形成更加密集、结构更加复杂的三维结构,见图2D。2.3游离状态、4hbf、48hbf的比较见表1、图3。48h最小抑菌浓度MIC从小到大依次为:游离状态、4hBF、48hBF,且两两之间的差异均有统计学意义(P<0.05)。3讨论3.1白假丝酵母菌的耐药生物膜是微生物为适应生存环境而形成的,是其不可逆地与无活力物体或活组织表面接触,由其自身产生多糖、蛋白或核酸等构成的细胞外多聚基质(extracellularmaxtrix,ECM)包裹自身菌落形成有结构的菌细胞群体。可形成生物膜的常见微生物有:淋病奈瑟菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、大肠杆菌、阴道加德纳菌、假丝酵母菌等。生物膜中的微生物拥有其浮游状态下根本不具备的生物学特性,几乎所有的微生物在生物膜中对绝大多数抗生素有较强的耐药性,在很多慢性感染中,微生物生活在生物膜中,从而成为宿主的一个持续性感染源。有资料显示在所有假丝酵母菌性感染中,白假丝酵母菌感染率占45%。同时由于白假丝酵母菌的生物膜对抗真菌药物具有较强耐药性,所以由白假丝酵母菌引起的感染常常难以控制并且反复发作。本课题测定了白假丝酵母菌在游离状态及生物膜状态下对抗真菌药物的MIC值,实验结果显示随着生物膜的逐渐成熟,其耐药性明显增强,同时也可以说明普通的药敏实验并不能确切的反应白假丝酵母菌的药敏情况。典型的白假丝酵母菌生物膜的形成分为三期:早期(1～11h),中期(12～30h),成熟期(31～72h)。Chandra等观察了白假丝酵母菌生物膜的形成过程,早期白假丝酵母菌细胞主要以芽生孢子(酵母相)的形态出现,随后芽管开始形成,出现分散的微菌落,并逐渐融合。中期的早期阶段(12～14h)主要是微菌落中的菌细胞不断分泌细胞外基质并且逐渐覆盖其表面,直至完全包裹。成熟的白假丝酵母菌生物膜是由细胞外基质包裹着细胞,厚度可达450μm,内有大量菌丝样细胞生长,形成一个在细胞外基质包裹下的由孢子、菌丝体和假菌丝组成的致密的网状系统,呈一个有机的三维结构。3.2荧光显微镜观察和模型建立的研究Basma等对116株临床分离的白假丝酵母菌进行耐药性研究,结果表明耐药性由高到低依次为:伊曲康唑<伏立康唑<酮康唑<氟康唑。同时刘华等在260例假丝酵母菌耐药性分析中发现,其中的155例白假丝酵母菌对不同药物的耐药率依次为:5-氟胞嘧啶(5.8%)<氟康唑(9%)=两性霉素B(9%)<制霉菌素(10.3%)<益康唑(40.9%)<酮康唑(43%)<咪康唑(43.7%)。相反吴达山在对102株阴道白假丝酵母菌药敏分析过程中发现不同药物的耐药性依次为:氟胞嘧啶(4%)<两性霉素(6%)<制霉素(11%)<酮康唑(27%)<伊曲康唑(48%)<咪康唑(51%)<氟康唑(70%)。基于上述的观点,为了排除真菌的耐药性是真菌本身已经存在的耐药性还是生物膜的耐药性以及更好的研究生物膜的药物敏感性,本课题所采用的白假丝酵母菌经过科玛嘉显色培养基分离培养、格兰染色形态学观察、纸片法药敏分析鉴定均为氟康唑敏感菌株。Martinez等研究了不同固体表面支撑材料对真菌粘附及生物膜形成能力的差异,发现新型隐球菌菌株B3501形成生物膜的能力依次为:聚氯乙烯>玻璃>聚苯乙烯>聚碳酸酯;在生物膜形成早期阶段(0～8h),新型隐球菌菌株B3501在玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯表现出相似的代谢活性,但是在玻璃表面形成的生物膜更好,本实验选用玻璃材质的盖玻片建立生物膜模型,一方面是为了能够建立更好的生物膜模型,另一方面也印证了前人的研究成果。实验中,虽然生物膜制备的过程相同,但由于荧光显微镜和扫描电镜的标本制备方式不同,用于电镜观察的盖玻片上的生物膜其细胞数目明显少于用于荧光显微镜观察的盖玻片上的生物膜,随着盖玻片冲洗次数的增多生物膜内的细胞数目会随之减少,相应的生物膜结构也必然遭到破坏。Strathmann等在荧光显微镜下观察铜绿假单胞菌SG81生物膜结构时,采用的是外源性凝集素和FITC共价结合的一种染料,实验浓度为10μg/ml,室温下避光孵育时间为30min。本实验中使用的荧光染料FITC-conA与上述的染料是同一性质,该染料是一种带有荧光的凝集素,可与多种糖基尤其与生物膜的多糖成分相结合,实验中发现浓度为10μg/mlFITC-conA时,延长避光孵育时间至2h后,荧光显微镜下观察仍旧几乎是一片黑色,偶可以看见少量暗淡的黄绿色荧光,逐步增加染料浓度至50μg/ml时,室温孵育30min后,显微镜下可见明亮的黄绿色荧光散在分布,产生这种差别的因素考虑为:(1)可能是因为孵育的温度和文献中所说的“室温”可能有差别,(2)可能是因为不同微生物形成生物膜的能力不同,(3)可能是因为荧光染料的种类不同。本课题利用FITC-ConA对白假丝酵母菌生物膜中菌细胞分泌的细胞外多糖进行染色,通过荧光显微镜观察不同时间阶段的生物膜中多糖成分的变化。研究发现随着时间的延长,生物膜中的菌细胞数量及细胞外多糖基质逐渐增多,48h已形成典型的生物膜结构,由此可见细胞外多糖成分在BF的耐药性当中起到重要作用。同时在扫描电镜下也可以看到上述典型的生物膜的动态形成过程。3.3耐药机制的复杂性微生物生物膜耐药机制目前尚不明确,人们发现其可能的耐药基质主要包括药物流出泵基因活性增加、细胞膜表面甾醇代谢异常、生物膜的机械屏障作用、生物膜内细胞的生长速率、对抗机体的免疫防御机制等,其中酵母样真菌对唑类抗真菌药物耐药性的产生可能的原因有:(1)编码14α-羊毛甾醇去甲基化酶的基因ERG11过度表达,(2)Erg11蛋白空间结构的改变使其对唑类抗真菌药物的亲和力降低,(3)由于编码药物流出泵基因MDR1、CDR1、CDR2的过度表达,抗真菌药物的跨膜转运导致细胞膜表面质子泵及ATP的耗竭,从而导致细胞的衰竭,(4)由ERG3基因编码的甾醇C5、C6-脱氢酶失活,从而使麦角甾醇生物合成途径受阻。另外,宿主本身的免疫防御机制在生物膜形成过程中也发挥了重要的作用。白假丝酵母菌生物膜具体的耐药机制之一可能与甘露糖结合受体及单核巨噬细胞有关,牛战琴等发现小鼠阴道上皮细胞表面的甘露糖结合受体介导了与白色念珠菌之间的粘附,此受体蛋白上的糖链可能参与了阴道上皮细胞的抗白色念珠菌作用。郑录清等指出单核巨噬细胞在对抗小鼠阴道假丝酵母菌感染中起保护作用,特别是对2次感染的小鼠,且局部作用大于系统作用。综上所述,生物膜是一种微生物为适应环境而形成的一种特定的生长方式,白假丝酵母菌生物膜的形成与其耐药性密切相关,由于生物膜的抵抗力主要取决于多细胞群体中的细菌聚集,应当将治疗策略锁定在破坏生物膜多细胞结构的形成。生物膜形成的影响因素和耐药机制的复杂性决定了生物膜相关性感染的临床治疗极为困难。由于其确切的耐药机制尚不明确,因而无法制定针对性的治疗方案。目前尚未形成国内外公认的治疗指南,现有文献报道均为个人经验。例如:王栾玲等认为,高浓度臭氧溶液治疗女性复发性外阴