人参白虎汤对糖尿病大鼠血管舒缩活性改变的保护作用

人参白虎汤对糖尿病大鼠血管舒缩活性改变的保护作用

糖尿病已成为影响大众健康的严重慢性疾病。诱发的血管并发症,更是被人们广泛重视。其中糖尿病大血管病变,如主动脉粥样硬化,糖尿病心肌病、脑血管病易于发生,且呈多部位性,以严重动脉粥样硬化为特点,是糖尿病致死致残的重要原因。大量实验证明,糖尿病时主动脉胶原及弹性蛋白的非酶糖基化产物增加,弹性下降,舒张作用减弱,血管痉挛。但对收缩及舒张功能变化特点及机制尚不完全清楚,所以本实验通过观察链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病大鼠胸主动脉环对Phe、Ach反应张力及在L-Arg、NLA及Ind温孵后反应张力改变的情况,进一步认识糖尿病主动脉收缩及NO,PGI2及EDHF等引起舒张的变化特点。人参白虎汤源于《伤寒论》,为中药临床治疗消渴证(现代医学之糖尿病)的著名方剂。为进一步研究和开发此方,我们就其活性部位进行了筛选,得到复合活性部位RB,并观察了其对糖尿病大鼠主动脉环舒张及收缩功能改善情况。1试剂与仪器1.1动物SD雄性大鼠,180～220g,购于南京医科大学实验动物中心。1.2受试药物人参白虎汤复合活性部位(RB):由人参、知母总多糖和总皂苷组成。根据人参、知母在原方中的配伍比例(1∶2)以及人参、知母总多糖和总皂苷提取得率将4种成分混合配伍,得到复合活性部位的受试药。1.3阳性对照药格列本脲(Gly):汕头金石制药总厂(批号:020606)。1.4试剂链脲佐菌素(STZ)、去甲肾上腺素(NE)、苯肾上腺素(Phe)、吲哚美辛(Ind)、L-硝基精氨酸(NLA)、L-精氨酸(L-Arg)均为Sigma公司产品,乙酰胆碱(Ach)为上海三爱思有限公司产品,其他试剂均为市售国产分析纯。1.5溶液0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,pH4.5。K-H液(mmol/L):NaCl119,NaHCO325,KCl4.6,KH2PO41.2,MgCl21.2,CaCl22.5,葡萄糖11。Phe梯度终浓度(mol/L)1×10-9,3×10-9,1×10-8,3×10-8,1×10-7,3×10-7,1×10-6,3×10-6,1×10-5。Ach梯度终浓度(mol/L)1×10-9,1×10-8,1×10-7,1×10-6,1×10-5。去甲肾上腺素(NE),吲哚美辛(Ind),L-硝基精氨酸(NLA),L-精氨酸(L-Arg)终浓度为1×10-5mol/L。所有溶液均用蒸馏水新鲜配制。pH值7.2～7.4。1.6仪器超级恒温水浴(501型,上海实验仪器厂);微机化生理药理实验教学系统软件(江苏生物医药工程学会电子技术研究所);JZ100,101型肌肉张力换能器(高碑店市新航机电设备有限公司)。2方法2.1大鼠分组及模型建立大鼠禁食12h后,腹腔注射STZ(溶解于0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液中,pH4.5)60mg/kg,两周后测空腹血糖(FSG),FSG(16.7mmol/ml作为糖尿病大鼠。正常对照组大鼠腹腔注射同体积0.1mol/L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。造模成功大鼠随机分为4组:模型组、RB高剂量组(100mg/kg·d-1,ig)、RB低剂量组(50mg/kg·d-1,ig)、格列本脲组(10mg/kg·d-1,ig),并设正常对照组。共给药75d。2.2u3000酸、碱分别滴定、干燥给药75d后,戊巴比妥钠(40mg/kg,ip)麻醉解剖迅速取出胸主动脉,置于4℃K-H液中持续通100%O2,仔细分离周围组织,剪成3mm左右主动脉环固定于3ml浴皿中,保持静息张力为1g。浴皿中置37℃K-H液并持续通100%O2,每20分钟换1次液,平衡1h。NE预处理两次后洗至初始张力。在4个浴皿中分别加入蒸馏水,L-Arg(1×10-5mol/L),L-NLA(1×10-5mol/L),Ind(1×10-5mol/L)各3μl。温孵10min后累积加入Phe(1×10-9～1×10-5mol/L)进行收缩,平台后累积加入Ach(1×10-10～1×10-5mol/L)进行舒张。利用换能器及平衡记录仪记录张力的变化。2.3结果处理和统计方法实验数据以均数±标准误表示,统计学采用多样本均数t检验。3结果3.1高血压大鼠abd-la的降压药,温度稳定的血管内皮扩张功能模型,见表1糖尿病大鼠主动脉环与正常大鼠相比对Phe敏感性加强,尤其是在高浓度(1×10-6,1×10-5.5,1×10-5mol/L)。模型组的收缩强度分别为(1.08±0.08,1.18±0.09,1.22±0.08g)比正常组(0.74±0.08,0.80±0.08,0.86±0.08g)分别增加45.94%(P<0.05),47.5%(P<0.05)和41.86%(P<0.05)。说明糖尿病模型中,大血管有一定程度的痉挛。药物治疗后有不同程度改善。高剂量RB在相应浓度的收缩分别是0.88±0.01,0.93±0.01,1.03±0.02g,较模型组改善58.82%(P<0.05),65.79%(P<0.05),52.78%(P<0.05)。格列本脲组则为0.80±0.02,0.89±0.03,0.99±0.02g,分别改善82.35%(P<0.05),76.32%(P<0.05),63.89%(P<0.05)。而低剂量RB作用不明显(图1)。—□—control;—●—model;—■—low;—◆—high;—▲—Gly糖尿病模型组主动脉对Ach敏感性下降,最大舒张百分比(Ach引起的最大舒张/Phe引起的最大收缩)明显降低。在Ach浓度为1×10-6mol/L和1×10-5mol/L时模型组分别为(18.46±5.18)%,(26.63±5.93)%,较正常组(36.93±6.69)%,(49.37±5.95)%)减少50.01%(P<0.05),46.02%(P<0.05)。提示糖尿病模型可以减弱血管对Ach引起的舒张反应。高剂量RB治疗后Ach引起的舒张为(28.61±7.58)%,(44.21±4.76)%分别较模型组改善54.95%(P>0.05),77.30%(P<0.05),格列本脲组舒张为(25.61±4.89)%,(34.38±3.57)%仅改善了38.71%(P>0.05),34.08%(P>0.05)。在1×10-5mol/L时高剂量RB组改善优于格列本脲,说明高剂量RB改善Ach诱导内皮舒张功能作用强于格列本脲。低剂量RB组改善不明显(图2)。—□—control;—●—model;—■—low;—◆—high;—▲—Gly3.2是否参保风-nla-ach,驳岸治疗后的内皮依赖性扩张在循环系统中,血管内皮细胞自发释放NO使血管保持一定的舒张状态,从而维持正常的血液循环。NO的这种释放被称为基础释放。NLA是NOS抑制剂能够抑制NO生成,阻断了NO诱导的舒张。NO合成阻断后,Phe收缩强度加强,在正常大鼠上升了0.25±0.03g,而模型大鼠只增加0.02±0.02g,两者有显著性差异(P<0.01),模型组较正常组减少了92%。提示在糖尿病模型中NO的基础释放比正常明显降低。RB高剂量治疗后Phe收缩强度增加了0.19±0.03g,说明NO的基础释放有一定恢复,较模型改善了59%(P<0.01),格列本脲也恢复NO基础释放59%(P<0.01)。RB低剂量仅改善4.2%(表1)。Contractionresponsetophenylephrine(Phe1×10-5mol/L)intheabsenceandpresenceofL-argine(L-arg1×10-5mol/L)andN-Nitro-L-argine(NLA10-5mol/L).Abbreviation:NLA-Phe:NObasalrelease;Phe-L-Arg:NOmaximumrelease.*P<0.05,**P<0.01vscontrol,#P<0.05,##P<0.01vsmodel在Ach诱导的内皮依赖性舒张中,加入NLA后舒张减弱,减少部分反应NO引起的舒张。在正常组NO诱导舒张为(30.33±5.56)%,模型组仅为(1.70±1.88)%,减少94%,RB高剂量和格列本脲治疗后舒张分别为(18.72±3.18)%,(19.16±2.05)%,均改善40%左右(P<0.01)。低剂量组作用不明显(表2)。Relaxantresponsetoacetylcholine(Ach1×10-5mol/L)intheabsenceandpresenceofN-Nitro-L-argine(NLA1×10-5mol/L),andindomethacin(Ind1×10-5mol/L)werecalculatedasapercentageofthephenylephrine-inducedcontraction.EDHFinducedrelaxationequalAch-NLA-Ind.*P<0.05,**P<0.01modelvscontrol,#P<0.05,##P<0.01vsmodel.Abbreviation:(Ach-NLA)/Ach:relaxationofNOinducedtorelaxationinducedbyAch;(Ach-Ind)/Ach:RateofrelaxationofPGI2inducedtorelaxationinducedbyAch;(Ach-NLA-Ind)/Ach:RateofrelaxationofEDHFinducedtorelaxationinducedbyAch3.3糖尿病大鼠合成nos的最适phe收缩通过加入L-Arg,可增加基础状态下NO的合成与释放。由于NO的释放增加,会使Phe引起的收缩减弱。此时减少部分反应内皮细胞对外源性L-Arg的利用能力,间接反应NOS最大合成NO能力即NO最大释放。正常组Phe收缩减少0.29±0.07g,而在模型组则减少0.04±0.03g,两者有显著性差异(P<0.01)。提示糖尿病大鼠对NO合成前体物质精氨酸的反应有明显减弱。RB高剂量治疗后较模型升高40%(P<0.01),而格列本脲与RB低剂量升高仅20%左右(P>0.05)(表1)。3.4rb对正常大鼠pgi2合成的影响PGI2是花生四烯酸在血管内皮细胞中代谢的主要产物,是一种强烈的血管平滑肌舒张剂。Ind能抑制PGI2生成所引起的舒张。正常大鼠PGI2引起的舒张为21.33±5.14%,模型组则为6.50%±1.36%(P<0.05),降低了70%。说明糖尿病模型中PGI2合成或释放比正常有所减少。RB高剂量治疗后较模型改善与格列本脲相当分别为61%(P<0.01),63%(P<0.01)。RB低剂量改善不明显(表2)。3.5edhf诱导的ach-lg-l内皮细胞依赖的舒张一般分为NO、PGI2及EDHF。Ach引起的血管舒张在温孵NLA,Ind后不会完全抑制,血管仍有舒张,这部分舒张认为是由EDHF引起。在本实验中,模型组NO及PGI2引起舒张减弱,Ach诱导舒张以EDHF为主,为91.88±1.5%。药物治疗后NO及PGI2舒张恢复,EDHF引起的舒张占总内皮依赖性舒张的比例趋于正常(表2)。4ach激动剂的作用机制长期以来,医生和病人都把注意力集中在控制血糖上。然而,依据当前对糖尿病理解,控制血糖虽然很重要,但不是导致并发症唯一因素,单纯降糖不能完全解决问题。所以在治疗糖尿病时,除血糖控制外还要考虑其他心血管危险因素。本实验中,糖尿病大鼠主动脉环对Phe反应张力显著高于正常对照组大鼠。表明Ⅰ型糖尿病在12周时就已出现主动脉收缩反应变化。糖尿病大鼠对肾上腺素收缩反应增强可能是对α受体亲和力、敏感性加强及儿茶酚胺类物质浓度较正常浓度升高有关,更主要是由于内皮细胞受损,舒张功能减弱而导致收缩功能增加。对Phe收缩反应增加提示在糖尿病早期,这种血管反应性增强可能是糖尿病易发展成高血压的原因之一。NO的合成是以L-精氨酸与分子氧为底物,在NOS的作用下生成NO与瓜氨酸。在体内瓜氨酸参与鸟氨酸循环产生内源性精氨酸,内源性精氨酸作为NO合成底物,参与NO基础释放。激动剂Ach引起的NO释放与NO的基础释放有所不同,它是当Ach与其受体结合后,激活内皮细胞内NO合成酶(eNOS),使NO的合成迅速上升。NO扩散出细胞浆,进入平滑肌细胞,作用于其受体鸟苷酸环化酶(GC)使cGMP含量上升,通过cGMP第二信使的作用舒张血管平滑肌。我们的实验结果表明,糖尿病组与正常组相比,NO基础释放减少,Ach诱发的NO释放减少及对外源性L-精氨酸的反应减弱,可能是糖尿病使血管舒张功能降低的原因。血管内皮NOS(eNOS)是钙依赖性的,糖尿病模型中IP3水平以及对钙-钙调素活性相对抑制,造成NOS活性下降。NOS活性的相对降低导致NO的释放减少。PGI2是血管壁环加氧酶主要产物,内皮细胞产生的比血管平滑肌产生的多10～20倍,所以其主要是内皮细胞产物。具有扩血管,抑制血小板聚集,并作为一种天然保护因子来防止动脉粥样硬