sz诱导大鼠型糖尿病模型的稳定性研究

sz诱导大鼠型糖尿病模型的稳定性研究

目前，已经报告了使用链香素（stz）建立糖尿病动物模型的研究。这些动物通常用于降低血糖药物的选择，并选择维持在较高的时期作为观察窗口，这有助于评估抗高血压药物的愈合效果。然而，关于stz注射后是否需要多长时间的糖达到较高水平并保持较高的报告略有不同。对未成模动物很少有人研究,其胰岛有无破坏,糖耐量有无异常,以后血糖是否会升高,是否可用于建立糖尿病模型等,都还缺乏研究。本实验采用空腹血糖测量、腹腔葡萄糖耐量试验以及形态学观察等方法对糖尿病动物模型稳定性进行了研究和探讨。1材料和方法1.1佐菌素、糖酸酯和甲基树脂雄性SD大鼠,10～12周龄,体重280～320g,由四川省医学科学院实验动物研究所提供。链脲佐菌素,瑞士ALEXIS公司;ONETOUCHSureStep微血糖测量仪,中国强生医疗器材有限公司;稳步医院用血糖试纸,美国LifeScanInc;羟乙基甲基丙烯酸树脂,德国HeraeusKulzer公司;OlympusBX50型生物显微镜,日本Olympus公司。1.2实验分组、材料和实验方法51只雄性SD大鼠,随机分为对照组15只,实验组36只。所有动物均喂养于SPF级动物实验室,室内通风良好,相对湿度为45%～65%,室温保持在18～26℃。分笼喂养,每笼5只,自由摄取水和大鼠标准颗粒饲料。适应性喂养2周后进行实验。将STZ临用前以0.1mol/L(pH4.2)的枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液溶解。在不禁食的条件下,实验组按60mg/kg一次性腹腔内注射STZ;对照组一次性腹腔内注射等量的缓冲液。1.3血糖值设定的意义在注射STZ或缓冲液后的第7、14、28、42、56和84d给动物禁食、禁水7小时后测空腹血糖(剪尾取血,用微血糖测量仪及配套的血糖试纸,最大血糖值为27.8mmol/L,更高的血糖值仪器显示为H,这种情况血糖值被当作为27.8mmol/L);然后从对照组轮流抽取4～5只动物,从实验组抽取所有空腹血糖<10mmol/L的动物进行腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT),即腹腔内注射葡萄糖(浓度50%,注射量2g/kg),30、60和120min后测量血糖,如果葡萄糖注射后120min血糖值大于相应对照组的所有动物的该值,且≥10mmol/L,IPGTT则为异常。1.4pas及苏苏叶精染色在注射STZ或缓冲液后的第84d,处死大鼠,取出胰腺置Bouin液内浸润固定,70%乙醇脱水后,行组织块等距随机抽样(每个胰腺共抽选8个组织块);将其中每2个组织块放入一个包埋盒中用树脂包埋;从每个包埋块间隔切取10μm厚的切片,共3张;选取第1张和第3张切片进行PAS及苏木精染色。每个胰腺共得8张切片。1.5胰岛的形态特征观察使用OlympusBX50型生物显微镜,在×10和×20物镜(数值孔径分别为0.30和0.50)和×10目镜下全面仔细观察整张切片,记录胰岛的形态特征以及胰岛内细胞核的多少、形态、大小和染色的深浅情况。1.6数据统计分析用SigmaStat1.0统计软件进行数据处理,数据以x¯±sx¯±s表示,两组之间的均值比较采用t检验,个别数据不服从正态分布时采用秩和检验。P<0.05为有统计学差异。2结果2.1模型模拟成功率实验组注射STZ后第7天血糖达成模标准(>11.1mmol/L)的大鼠(成模组)有19只,血糖未达成模标准的大鼠有10只,死亡7只,模型成功率为53%。2.2一般条件下的情况随着病程进展,成模组大鼠逐渐出现多饮、多尿、多食、毛失去光泽、脱毛、消瘦、活动减少和伤口易感染等表现,部分出现白内障。2.3未成模大鼠iprtt正常对照组、成模组(含各天死亡动物)的空腹血糖结果见表1,对照组IPGTT均正常。未成模大鼠中,3只IPGTT异常,并分别在第14、28和第42d血糖达成模标准;5只IPGTT异常,各天血糖正常;2只IPGTT各天血糖均正常。2.4成模组胰岛细胞形态和大小不确定量对照组胰岛多为圆形或椭圆形的细胞团,界限清楚,数量较多;胰岛内细胞数量较多,见图1。成模组胰岛数量明显减少,形态不规则;胰岛内细胞数量减少,核的形态和大小不均一,部分胰岛内细胞核较密集,染色较深,见图2、3。未成模大鼠有的胰岛似对照组胰岛的形态结构,有的胰岛似成模组胰岛的形态结构。3糖尿病模型成功与否的判断本实验表明,在不禁食的条件下,给雄性SD大鼠按60mg/kg一次性腹腔内注射STZ后,第7天血糖达成模标准的大鼠(成模组)有19只,死亡7只,模型成功率为53%,不及一些文献报道的可达80%～90%。我们推测与给药时间(空腹或非空腹时)、途径(静脉或腹腔内注射)以及动物种属、大小、饲养条件等有关。部分大鼠在注射后1周内出现突然死亡,此时为糖尿病模型大鼠最易死亡的一个时期,推测是由于大鼠的体质不尽相同,而STZ具有一定的毒性和副作用,导致大鼠死亡。因此,这段时间内应特别注意大鼠的饲养,加强各种保护措施,尽量减少大鼠的死亡率。目前一般认为大鼠腹腔注射STZ第3d后血糖达到规定的标准即可认为造模成功。本实验在注射STZ后第7、14、28、42、56和84d检测了空腹血糖,来考察模型的稳定性,发现成模组血糖始终在高血糖水平上波动,且未见转复,这与于德民等研究的报道一致,但未发现其血糖随病程的延长而有所提高,或有自发性缓解的现象;同时大鼠出现多饮、多尿、多食、消瘦及白内障等表现,符合糖尿病诊断标准;胰腺切片形态学观察显示,胰岛数量明显减少,形态不规则,胰岛内细胞数量减少等,进一步证实了模型的稳定性良好。本实验提示,STZ注射后7～84d是观察降糖药物疗效的最适宜时段。判断造模成功的指标,研究中多采用测外周血糖、尿糖、血清胰岛素水平和C肽值等。国外有学者采用口服葡萄糖耐量试验(OGTT)作为判断与比较糖尿病情况的指标之一,OGTT是在当血糖升高的程度未达到糖尿病诊断标准,不能确诊糖尿病而进行的一种进一步确诊糖尿病的检验措施。但目前在用STZ诱发大鼠糖尿病模型的研究中,只用空腹血糖值作为判断大鼠成模的指标,较少使用OGTT。本实验给所有空腹血糖<10mmol/L的动物进行了腹腔葡萄糖耐量试验(IPGTT),发现在注射STZ后第7天血糖未达成模标准的大鼠(10只)中,3只IPGTT异常,并分别在第14、28和第42d血糖达成模标准,5只IPGTT异常,但各天血糖正常,2只IPGTT各天血糖均正常;未成模大鼠中有的胰岛似对照组胰岛的形态结构,有的胰岛似成模组胰岛的形态结构,这与黄波等报道的未成模动物胰岛的形态结构类似于正常对照组不完全相同。以上说明未成模大鼠的胰岛也受到不同程度的破坏,虽然开始未达成模标准,但大部分大鼠(8只)已导致糖耐量减退,以后小部分大鼠(3只)血糖达成模标准,且未见转复,故我们认为,这部分大鼠也可作为I型糖尿病模型。有学者研究表明,动物实验中空腹血糖值并不能很准确地反映出动物成模的真实情况,有的大鼠其空腹血糖值虽正常,但OGTT结果显示其糖