细菌性阴道病患者阴道加德纳菌感染的实验室检测方法的应用

细菌性阴道病患者阴道加德纳菌感染的实验室检测方法的应用

阴道感染（gva）是女性非特异性阴道疾病（bv）的常见病原体，也是性接触和传播疾病的病原体之一。GVA不仅引起阴道炎和尿道炎、还可引起早产、低体重儿、急性输卵管炎、手术感染和子宫颈癌等。我们对临床常用的3种检测方法与本实验室研发的GVA选择性培养基分离培养法进行比较,取得了满意的效果。为细菌性阴道病的诊断和治疗提供简便易行的检测方法,报道如下。1材料和方法1.1组与组成一般资料2005年2~12月我院妇科诊断为泌尿生殖道感染患者156例,年龄19~62岁,诊断标准参照乐杰主编《妇产科学》第5版。1.2细菌、试剂和仪器阴道加德纳菌选择培养基“加德纳琼脂平板”购自法国生物梅里埃公司,阴道加德纳菌选择性平板由本院微生物室研制(营养肉汤粉15~20g;哥伦比亚琼脂35~44g;吐温800.2~0.4ml;革兰染色1液(结晶紫液)0.05~0.075ml;5-氟胞嘧啶0.02~0.03g;人全血50~80ml;人或羊血浆30~50ml;蒸馏水加至1000ml,pH为7.2~7.4),鉴定系统采用法国生物梅里埃公司“APICRYNE棒杆菌鉴定系列”或VITEK-2MH卡片;药敏试纸、马尿酸试验微量管购自杭州天和试剂公司;细菌性阴道病快速诊断试剂盒,购自珠海斗门浪锋生物技术有限公司。自制50μg/片甲硝唑和替硝唑药敏纸片。1.3方法1.3.1中小型提高适用对象:妇幼保健入院正常妇女A组:宫颈炎患者100例;B组:阴道炎患者56例;C组:妇科体检正常妇女36例做为对照组。3组均用无菌棉拭子采取宫颈和阴道分泌物涂片革兰染色找线索细胞、胺试验、BV试验、白带常规检查,并同时进行细菌培养。1.3.2革兰阳性菌种的制备分泌物分别接种于加德纳菌选择性平板置5%CO2孵育箱培养48h;挑取淡紫色凸起、半透明、光滑、露滴样且周围有β-溶血环小菌落纯化,涂片染色为具有多形性革兰阴性杆菌或革兰阳性球菌;同时进行马尿酸试验;结果判断,鉴定条上吡嗪胺酶、葡萄糖、核糖、丙二酸盐阳性,其他为阴性,并马尿酸试验阳性鉴定为阴道加德纳菌。1.3.3药物过敏试验采用K-B纸片扩散法,参照苛养菌体外药敏试验方法作为试验结果判定标准。1.4统计处理计数数据在SPSS11.5软件上进行配对资料χ2检验(校正公式)及相关性分析。2结果2.1两组检测方法阳性率比较经配对χ2检验,宫颈炎患者和阴道炎患者与对照组比较各项检测方法阳性率差异均有统计学意义(P<0.05)。宫颈炎患者与阴道炎患者比较各项检测方法阳性率只有BV试验差异有统计学意义(P<0.05),宫颈炎患者GV培养法与涂片找线索细胞、BV试验阳性率差异无统计学意义;而与胺试验阳性率差异有统计学意义(P<0.05);阴道炎患者GV培养法与涂片找线索细胞、胺试验阳性率差异无统计学意义;而与BV试验阳性率差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表1。2.2自制培养基中病原菌分离率两种琼脂平板加德纳菌分离率差异无统计学意义,而自制培养基中其他病原菌与进口培养基相比分离率差异有统计学意义(P<0.05)。结果见表2。2.3抗癫痫试验分离的65株阴道加德纳菌对临床常用的8种抗菌药物在M-H人血琼脂平板上进行抗菌药物敏感试验,结果见表3。2.4两种部位的抗病性分离率宫颈分泌物与阴道分泌物GVA的分离率差异无统计学意义,20例宫颈糜烂患者同时取阴道分泌物与宫颈分泌物培养,结果见表4。2.5由于gva分离与分泌物ph的关系分泌物的pH值越大GVA分离率越高,呈高度正相关r=0.988。GVA的分离与分泌物的酸碱度(pH值)有较好的相关性分析,见表5。2.6比较gva分离与分泌物数量之间的关系分泌物中白细胞越多GVA分离率越少,呈高度负相关r=-0.956。阴道加德纳菌的分离与分泌物的白细胞数多少的相关性分析,见表6。3讨论3.1培养基的选择加德纳菌在普通培养基上不易生长,本课题研发了一种GVA的选择性培养基配方和配制方法,特别是采用低浓度的结晶紫代替抗菌药物作为革兰阳性菌抑制剂,用于GVA培养基在目前国内外培养基配方中未见报道;用较高浓度的5-氟胞嘧啶作为真菌抑制剂,则提高了对真菌的抑制效果并大大减少了成本;该培养基以营养肉汤作为基础培养基,加入一定量的血浆,增加了营养成份,GVA在该培养基上生长良好。自制加德纳菌选择性平板具有GVA生长良好,有效抑制了革兰阳性菌和真菌生长、杂菌少、培养基成本低、配制简便等优点。GVA生长需要提供5%CO2环境,置5%CO2孵育箱和置含5%CO2的Ⅱ型气袋内均能达到相同的培养效果。研究结果为非特异细菌性阴道病,特别是阴道加德纳菌感染的泌尿道炎症诊断提供实用、有推广价值的检测手段。3.2gva培养法与涂片革兰染色找线索细胞、bv、分离培养的阳性率比较表2目前对BV的检测方法颇多,最常用的有Asmel的传统诊断法:(1)阴道pH>4.5。(2)稀薄均质灰白色的阴道分泌物。(3)胺试验阳性。(4)涂片革兰染色检到线索细胞。诊断条件应具备上述4条中的3条;其他还有分离培养、免疫荧光枝术、聚合酶链反应(PCR)、气-液相色谱分析及基因探针检查等。本调查156例阴道病患者同时采用分泌物涂片革兰染色找线索细胞、BV试验、胺试验、分离培养,经配对χ2检验,可见宫颈炎患者GVA培养法与涂片找线索细胞、BV试验阳性率差异无统计学意义;而与胺试验阳性率差异有统计学意义(P<0.05),可能是由于标本量不足使胺试验出现部分假阴性;阴道炎患者GVA培养法与涂片找线索细胞、胺试验阳性率差异无统计学意义;而与BV试验阳性率差异有统计学意义(P<0.05);说明阴道病患者除GVA感染外还存在较多的其他病原菌,如普雷沃菌属等也能产生唾液酸酶而引起BV试验的阳性。涂片革兰染色找线索细胞虽然是目前检查BV的金标准,方法也简便,但由于阴道分泌物中杂菌及脱落细胞较多,不易识别,再加上判断结果中常带有主观因素,而影响检查的准确性,因此分泌物涂片革兰染色找线索细胞、BV试验、胺试验只能作为一种过筛试验;其他方法的共同不足是都不能分离到GVA病原菌,而本方法即能从BV患者标本中分离培养得到GVA病原菌并进行药敏试验,既提高了特异性的诊断依据,又可同时给出治疗参考,对临床反复发作的GVA感染患者的确诊和治疗更具指导意义。3.3gva合并用药试验对分离所得65株GVA对8种抗菌药物进行敏感试验,可见GVA对头孢类、青霉素类抗菌药物比较敏感,而对喹诺酮类、氨基糖苷类药物敏感率较低。由此可推荐对GVA引起的阴道炎如未做药敏试验的病例,临床可首选头孢类或青霉素类与甲硝唑或替硝唑抗菌药物联合治疗,可明显提高治疗效果。笔者认为甲硝唑或替硝唑类抗菌药物能很好地杀灭厌氧菌,主要通过改变生殖道的pH值来抑制GVA的生长,而直接对GVA的杀灭作用并不明显。3.4环境条件适用gva的生长目前对GVA的分离培养大多采用无菌棉拭子取阴道分泌物。研究显示,取宫颈分泌物培养结果优于阴道分泌物,且有杂菌少、pH值高、菌落生长良好和便于分离等优点。可能近宫颈处的环境条件更适合GVA的生长。试验还显示,GVA的分离率与分泌物的pH值高低呈高度正相关。进一步证明了阴道乳酸杆菌的优势地位被大量GVA或混合性厌氧菌所代替,菌群失调及所致的阴道内pH值的变化是引起BV的主要原因。GVA的分离率与分泌物中白细胞数的多少呈高度负相关。GVA能产生唾液酸酶,而可以分解针对GVA溶血素的IgA,使GVA的溶血素得以破坏白细胞,致使BV成为一种病理上无明显炎症的疾病。因此,当可疑为BV时仅将阴道分泌物做常规的、特异性低的检查,显然不足以为临床确诊提供更具说服力的证据。3.5gva与bv的比较本调查报道156例BV患者GVA的总检出率为39.7%,其中100例宫颈炎患者的GVA检出率为41%;56例阴道炎患者的GVA检出率为37.5%;而36例健康妇女GVA检出率仅为8.3%,BV患者与健康妇女二者比较差异有统计学意义(P<0