黄连解毒汤对小鼠肠道菌群的影响

黄连解毒汤对小鼠肠道菌群的影响

在人体的体表和身体腔中发现了许多不受影响的微生物，尤其是肠道中存在各种微生物，这些微生物被统称为肠道菌群。这些微生物群对其宿主非但无害，而且有益，并有众多的生理效应，这是正常微生物群与其宿主长期共生的进化结果。一般情况下，肠道菌群与人体和外部环境保持着一个平衡状态，对人体的健康起着重要作用。很多文献均已证明过量使用抗生素将造成人体肠道菌群失调，造成二次感染，威胁人类生命。根据中医理论，过量或长期服用苦寒的清热解毒中药将损伤脾胃、耗伤正气，也有报道部分苦寒中药例如黄连解毒汤等在体外有抑菌杀菌作用，而如果滥用苦寒中药是否有类似于抗生素的破坏作用还未见报道。而传统上中草药的使用，绝大多数以方剂的形式通过口服吸收而发挥作用，药物中的有效成分在进入肠道之后不可避免地与肠道菌群发生关联，故对于中药，体外实验并不能完全代替体内的研究。本研究建立了抗生素引起的菌群失调模型和不同剂量的黄连解毒汤灌胃模型，与正常小鼠进行比较，尝试在小鼠体内通过观察肠道菌群变化来研究黄连解毒汤对小鼠的影响，以期为临床合理使用清热解毒中药提供参考资料。1材料和方法1.1材料表面1.1.1动物昆明种小鼠，由中山大学北校区实验动物中心提供，体重18～22g，雌雄不限。1.1.2麻黄溶解汤盐酸林可霉素注射液为天方药业股份有限公司产品；黄连解毒汤（黄连、黄岑、黄柏、栀子）由中山一院药房提供，常规煎制，浓缩至1g/mL生药量，4℃保持备用。1.1.3培养基MRSA培养基、BS培养基、肠球菌琼脂、麦康凯培养基、BHI培养基由青岛高科园海博生物技术有限公司出品。1.1.4实验仪器和方法YXQ-LS-50SⅡ立式压力蒸汽灭菌器、洁净工作台、旋转蒸发仪、FA2004N电子天平、PV-1漩涡混匀器、金花加样器、PYX-DHS-50×65-BS-Ⅱ隔水式电热恒温培养箱、825-A型厌氧菌培养罐、BX51型荧光明场数码显微镜均由中山大学基础医学实验教学中心提供。1.2方法1.2.1实行药物急性毒性昆明种小鼠40只，随机分为正常组、抗生素组、黄连解毒汤高剂量组、黄连解毒汤低剂量组4组，每组10只。抗生素组给予盐酸林可霉素灌胃，每日每只60mg；黄连解毒汤高剂量组给予黄连解毒汤灌胃，每日每只0.15g；黄连解毒汤低剂量组给予黄连解毒汤灌胃，每日每只0.075g；正常组给予生理盐水灌胃，每日每只0.6ml。各组均灌胃14d。1.2.2行为观察每天观察和记录各组小鼠外形、活动、饮食、排便情况，实验进行第1天、第7天、第14天称量和记录小鼠体重。1.2.3巴结及胰腺的制备脱颈椎处死小鼠，解剖后无菌取小鼠淋巴结、脾脏，淋巴结及脾脏放入无菌玻璃研磨器内，加入等体积无菌生理盐水，充分研磨后稀释10倍，取100μl，涂于BHI培养基上，37℃有氧条件下培养24h后观察。1.2.4cfu/g标本将小鼠断椎处死，常规消毒后正中剪开腹腔，找出回盲部，无菌条件取出盲肠内容物涂于洁净玻片上，革兰染色后镜检计数球菌和杆菌的比例，另取盲肠内容物0.1g，置于装有玻璃珠的无菌试管内，加0.9ml生理盐水，于震荡器上震荡15min，使盲肠内容物均质化。将上述震荡好的标本进行10倍系列稀释至106。选用104、105、106的稀释度，以灭菌吸头，自高稀释度向低稀释度在相应的培养基上各滴加50μl稀释液，待滴种好的培养基吸干后，放入37℃温箱中培养。其中MRSA培养基（分离乳酸杆菌）厌氧培养48h,BS培养基（分离双歧杆菌）厌氧培养72h、肠球菌琼脂（分离肠球菌）需氧培养24h、麦康凯培养基（分离肠杆菌）需氧培养24h。待菌落长出后，以菌落形态、革兰染色、生化反应鉴定所需目的菌。培养好的细菌经鉴定后计算每克盲肠内容物中的细菌数量，即CFU/g标本。选择菌落适中的稀释度，算出同一稀释度平均菌落数（X）。公式：CFU/g标本=X/0.05×稀释倍数×1/标本重量（g）。结果用常用对数值lgCFU/g表示。2结果2.1高剂量又成反应时小鼠摄食量和体重变化情况正常组小鼠饮食正常，行动活跃，被毛平整光滑，粪便正常。抗生素组小鼠摄食量下降，精神萎靡，行动迟缓，被毛无光泽，畏寒扎堆，大便稀湿。高剂量组小鼠摄食量亦下降，行动较迟缓，被毛无光泽，大便稀湿。低剂量组小鼠饮食正常，行动活跃，被毛平整光滑，粪便正常。正常组小鼠体重增加，抗生素组体重下降，与正常组比较差异有统计学意义；高剂量组体重明显下降，与正常组比较差异有统计学意义（P<0.05）；低剂量组体重上升，与正常组比较差异无统计学意义（表1）。2.2小鼠细菌位移的比较正常组未见细菌移位。抗生素组细菌移位现象比其它组明显，有50%的小鼠共5例出现细菌移位现象，分别是移至肠系淋巴结4例，移至脾脏1例；高剂量组有2例，均是移至肠系淋巴结；低剂量组未见细菌移位。2.3抗生素对肠球形菌群的影响据刘勇报道，临床对肠道菌群状况分析以球菌与杆菌比例的方式报告，简称球菌杆菌比，参考值为1∶3（成人）。如结果在参考范围内，则表明菌群正常，如果球菌杆菌比大于1/3，表明菌群失调，比值越大，失调越严重。本实验中，各组小鼠盲肠内容物球菌杆菌比镜下统计结果显示，正常组肠道菌群球菌杆菌比为1/15即小于1/3，其菌群组成正常。抗生素组菌群球菌杆菌比大于1/3，提示其菌群失调，抗生素组模型构建成功。高剂量组球菌杆菌比为2/5，大于1/3，亦属菌群失调，但其比例小于抗生素组，失调情况不及抗生素组严重。低剂量组球菌杆菌比小于1/3，即菌群组成正常。目的菌培养情况统计结果见表2，与正常组比较，抗生素组和高剂量组的乳酸杆菌均显著减少，低剂量组与正常组之间数量接近，抗生素组和高剂量组之间无差异；各组的双歧杆菌的统计结果与乳酸杆菌的情况类似；各组的肠球菌两两相比，差异均有统计学意义（P<0.05），抗生素组的条件致病菌肠球菌显著增加，高剂量组的肠球菌亦增加，而低剂量组的肠球菌低于正常组。抗生素组和高剂量组的大肠埃希菌数量均高于正常组的，差异有统计学意义；低剂量组的大肠埃希菌比正常组少，但差异无统计学意义。3抗生素对小鼠肠道菌群的影响《内经·灵枢·邪客》说：“人与天地相应也”。不但人体本身是一个有机的整体，人体的各种功能互相协调、彼此为用，而且人和环境之间也是互相影响的，是一对不可分割的整体，当自然环境发生变化时，人体也会发生与之相应的变化，即“天人相应”的思想。微生态学也认为一切生物都是环境的对立统一体。在微生态的研究中，可以运用中医天人相应的整体观作为指导思想，就是要处处注意调节人体与微生物之间内环境的动态平衡，以及人体（包括微生物群）与外环境的平衡。微生态学认为微生态失调是微生物致病的本质。微生态失调时系统由相似于中医的正气（平衡）向邪气（失平衡）转化，其所产生的病理作用可表现为菌群失调、菌群易位或外籍菌入侵。如感染性疾病，由于长期、大剂量使用抗生素，在控制感染的同时，也大量杀伤原籍菌，造成菌群失调，破坏了定植抗力，而使耐药性的细菌定植繁殖，形成新的二重感染。观察本实验中各组小鼠的外观、体重变化曲线可见，与正常组小鼠比较，抗生素组小鼠在实验后期明显出现食欲不振、体重下降、被毛无光、活动减少、大便稀湿等现象，高剂量组也有类似情况出现。抗生素处理后肠系淋巴结或脾脏细菌移位现象比其它组明显，而高剂量组亦有2例移位现象。另外，肠道菌群比较分析显示，正常组菌群比例正常，抗生素组小鼠肠道菌群球菌杆菌比大于1/3，出现菌群失调，双歧杆菌、乳杆菌等有益菌数量下降。高剂量组与正常组比较，其双歧杆菌、乳杆菌数量亦有显著差异，且球菌杆菌比大于1/3，已出现菌群失调。可见肠道菌群变化，与宿主的精神状态、食欲、体重等状态的变化有相关性。体现为肠道菌群正常，个体的状态良好；肠道菌群失调，个体的状态变差。抗生素组小鼠的盲肠内容物涂片镜检可见球菌杆菌比大于1/3，达到临床上菌群失调的标准，另外细菌移位也显著高于正常组，说明抗生素引起的菌群失调模型已经构建成功。其对机体有益的双歧杆菌和乳酸杆菌大量减少，条件致病的肠球菌异常增多，与正常组有显著差异。肠道微生态平衡是肠黏膜发挥正常功能的基础。在这种微生态失调的情况下，机体的定植抗力下降，使外袭菌容易入侵定植或条件致病菌过量增殖移位而引起感染。高剂量组的各种目的菌也有类似的情况，双歧杆菌和乳酸杆菌与正常组比较明显减少，肠球菌增多情况虽不及抗生素组增加的幅度，但也与正常组有差异，且涂片镜检可见球菌杆菌比大于1/3，结合细菌移位情况，提示我们高剂量组与